1.背景

叶酸是水溶性B族维生素的一员，天然存在于各种食品中。它在细胞分裂、DNA/RNA合成和氨基酸代谢等众多生化过程中发挥重要作用。叶酸水平不足与几种健康并发症有关。鉴于人体不能在内部合成叶酸，从饮食来源和补充剂中获取叶酸对于避免叶酸缺乏是必不可少的。欧洲食品安全局(EFSA)建议成年人每天摄入400μg叶酸，建议妇女在怀孕前和怀孕期间增加到600μg/d。叶酸相关药物包括叶酸、亚叶酸钙和5-甲基四氢叶酸等。5-甲基四氢叶酸是血清中叶酸的主要形式，为活性叶酸，可作为普通叶酸补充剂的替代品。亚叶酸钙也是叶酸在人体内的一种活性形式。亚叶酸钙本身不是化疗药，但其对某些化疗药物具有增效和解毒的功能，它可以抑制DNA合成，发挥抗肿瘤的作用。

2024年03月多家企业1 mg规格的叶酸片因为叶酸亚硝胺杂质含量超标在加拿大发生召回。2024年10月，JAMP的妊娠复合维生素也因为叶酸亚硝胺杂质含量超标发生召回。EMA和FDA也在药物潜在亚硝胺列表中对叶酸、亚叶酸钙、5-甲基四氢叶酸的亚硝胺结构和AIs进行了说明，其结构如下图1。

图1叶酸系列药物亚硝胺杂质的结构

2.叶酸系列药物合成分析的难点和部分结构表征

为解决叶酸系列相关药物和营养品中亚硝胺杂质的检测问题，我们合成了以上三种亚硝胺杂质。在合成过程中我们发现，由于叶酸系列相关药物极性均较大，且合成的亚硝胺杂质在溶液中呈浆状，难以分离纯化。通过对合成方法进行优化，我们完成了以上三种亚硝胺杂质的合成。以亚硝基叶酸的1H NMR为例，核磁氢谱归属如下图2。受亚硝基吸电子影响，与叶酸的核磁氢谱相比(Ref:Macromolecules 2018, 51, 9069−9077, ESI)，亚硝基附近的氢原子明显向低场移动。

图2亚硝胺叶酸的核磁氢谱

在对亚叶酸钙的定量分析中我们发现，类似于DMF对NDMA的干扰，亚叶酸钙EP杂质B也对亚叶酸的亚硝胺杂质定量测试有影响，形成假阳性。其主要原因是亚叶酸钙EP杂质B和亚硝胺亚叶酸分子量仅相差1，其同位素峰与亚硝胺亚叶酸极为接近，会对亚叶酸的亚硝胺杂质的定量测试造成干扰。亚叶酸钙EP杂质B、亚叶酸和亚叶酸亚硝胺极性较大，液相上出峰也很接近，对分析测试也带来一定挑战。亚叶酸钙EP杂质B结构和亚叶酸亚硝胺杂质的质谱图如图3。亚叶酸亚硝胺的质谱图中，m/z=503.16[M+H]+为亚叶酸亚硝胺杂质峰，m/z=476.17[M+H-NO]+为亚叶酸亚硝胺质子化后失去NO形成的自由基阳离子峰，m/z=445.17[M+H-NO-CO]+为甲酰基部分进一步失去CO后的信号峰。我们通过优化了质谱分析定量参数，并使用高分辨质谱测试，解决了这一问题。亚硝胺作为基因毒杂质，限度非常低，而不同亚硝胺限度不一样。开发检测方法时,需重点关注其专属性，避免出现假阳性和假阴性检测结果。凯瑞德医药有着丰富的亚硝胺杂质研究经验，能很好的为客户解决药物申报过程中亚硝胺杂质研究的各种问题。

图3亚叶酸钙EP杂质B结构和亚叶酸亚硝胺杂质的质谱图

凯瑞德医药作为国内较早进行药物制剂研发技术输出以及ICH国家药品上市服务的公司，自2008年成立至今，一直秉承“客户至上”的理念，现已发展成为具有百人研发团队，同时配备占地超5000平研究实验中心的大型CRO公司，为了快速高效的完成客户交付的任务，凯瑞德配备多种基础和前沿研发设备，打造“新的注册技术及研究平台”，可保证在进行国内药品申报的同时符合国际规范要求，实验室体系执行OMCL标准，可接受海外官方核查。技术开发模式包括从产品立项、处方设计、处方优化、中试放大、临床研究/BE等服务内容。