大家好，今天我们来聊一聊 海洋衍生生物材料在3D 生物打印的引言——《Recent Developments in Bio-Ink Formulations Using Marine-Derived Biomaterials for Three-Dimensional (3D) Bioprinting》。3D 生物打印具有巨大的应用潜力，在生物医学、制药等领域有望带来革命性的变化。其中，海洋衍生生物材料在生物墨水配方中发挥着重要作用。这些材料来源丰富，具有良好的生物相容性和可降解性。然而，它们在应用中也面临一些挑战。接下来，我们将深入探讨 3D 生物打印技术、海洋衍生生物材料的应用及挑战等内容。
*本文只作阅读笔记分享*
一、引言
3D 生物打印是一种新兴且先进的计算机辅助增材制造技术，能够精确地逐层构建复杂的 3D 结构，在生物医学、制药和食品等领域具有巨大的应用潜力。本文旨在对使用海洋衍生生物材料进行三维（3D）生物打印的生物墨水配方的最新发展进行综述。
二、3D 生物打印技术概述
（一）技术分类
当前 3D 生物打印技术主要包括基于喷墨、基于挤压和基于光聚合三大类，每种技术都有其特定的优势、缺点和局限性。
（二）喷射式生物打印
影响因素
生物墨水性质：Ng等人的研究表明，生物墨水的粘弹性和粘度会影响打印性能和细胞健康。例如，更高的生物墨水粘弹性有助于在喷嘴孔破裂前更好地稳定液滴细丝，更高的粘度有助于促进液滴在基板表面的沉积，并提高液滴沉积的准确性。同时，使用粘性生物墨水进行打印有助于维持更高的细胞存活率。
细胞浓度：Xu等人的研究发现，在喷射式生物打印过程中，细胞浓度与液滴大小和速度呈负相关，与破裂时间呈正相关。即增加细胞浓度会导致液滴大小和速度减小，而破裂时间增加。
其他物理因素：剪切应力、液滴冲击速度和体积也会影响细胞存活率。例如，Blaeser 等人的研究表明，短时间暴露于高水平剪切应力会对细胞存活率产生立即的负面影响，并可能导致未受影响细胞的增殖潜力发生长期变化。
此外，Ng等人的研究指出，增加细胞浓度会导致液滴冲击速度变慢，从而提高打印细胞的存活率。同时，研究发现最小液滴体积为20 nL/点可减少细胞因蒸发而受损的情况，并在2分钟的打印时间内保持细胞的存活率。
技术分类
喷墨生物打印：成本低、打印速度高、细胞存活率较高，但不适合高粘度生物墨水，因为存在 “沉降效应”，会导致生物墨水粘度增加和打印机头堵塞。例如，当细胞在墨盒中随时间沉降时，会导致生物墨水粘度增加和打印机头堵塞。
微阀生物打印：分辨率和细胞存活率高，打印速度快，但面临生物墨水粘度的挑战，需要确保高粘度生物墨水在不影响细胞存活率的情况下可靠打印。
激光辅助生物打印：分辨率和细胞存活率高，适用于高细胞密度和高粘度生物材料的打印，但会降低细胞存活率，这是由于激光诱导的前向转移过程中产生的热损伤。例如，研究表明，在激光辅助生物打印中，纳米秒级激光曝光引起的热损伤会降低细胞存活率。
声学生物打印：通过超声波辅助实现液滴喷射，液滴大小可通过控制超声波频率来调节，因为液滴大小与频率成反比。
（三）挤压式生物打印
特点：是目前最广泛使用的生物打印方法，能够处理更高的细胞密度和使用高粘度生物材料，但速度较慢。
影响因素：生物墨水的粘度对打印性能有双重影响，高粘度通常会导致更高的细丝保真度和结构完整性，但会影响挤出性，需要更高的压力，从而增加剪切应力，可能导致细胞膜破裂和细胞损伤。此外，生物墨水的粘弹性和表面张力也会影响打印性能。
细胞存活率：细胞在打印过程中会受到剪切应力等机械力的影响，剪切应力是导致细胞损伤和死亡的主要原因，高粘度生物墨水需要更高的压力，从而增加剪切应力，对细胞存活率产生负面影响。
（四）光聚合式生物打印
关键因素：光源是影响细胞存活率和打印速度的关键因素，在光聚合过程中，不饱和分子通过光子能量转化为固体大分子，紫外线和可见光等光常被用于诱导聚合，但紫外线可能导致基因修饰和细胞死亡，因此可见光在克服细胞存活率挑战方面具有优势。
光聚合材料：生物墨水中的光聚合物在光聚合生物打印中起着重要作用，常用的光聚合物是反应性多功能单体、低聚物、聚合物或它们的混合物与光引发剂的组合，但当前光聚合物存在内部收缩的问题，会导致固化的生物墨水变形和形状损失。
技术分类：包括立体光刻、双光子聚合和数字光处理等技术。
立体光刻生物打印：是一种多功能技术，能够设计和制造各种结构，但使用的紫外光在聚合阶段可能会导致严重的健康问题，如 DNA 损伤和癌症。例如，在立体光刻生物打印中，使用紫外光进行聚合可能会导致 DNA 损伤，从而引发癌症等健康问题。
双光子聚合：是一种光化学3D微制造过程，能够制造分辨率高达 100nm 或更高的 3D 结构，但在纳米尺度分辨率下的生物打印不实用，在微米分辨率范围内更有用，可用于制造支架、纳米和微机器人以及微流体。例如，研究发现，双光子聚合可用于制造分辨率高达 100nm 的 3D 结构，在制造支架、纳米和微机器人以及微流体等方面具有应用潜力。
数字光处理生物打印：是一种快速而强大的生物制造技术，能够生产具有复杂几何形状和高分辨率的 3D 结构，其打印速度比挤压式生物打印快，与激光基立体光刻生物打印相比也具有更快和更高效的特点。例如，在数字光处理生物打印中，通过使用数字微镜设备或液晶显示器，可以快速地生产出具有复杂几何形状和高分辨率的 3D 结构。
三、用于生物墨水配方的海洋衍生生物材料
（一）多糖类海洋衍生生物材料
壳聚糖：是甲壳素的脱乙酰化衍生物，化学结构如下图所示。
制备方法包括化学和酶促过程，化学过程需要高能量输入并产生有害化学废液，酶促过程面临选择、培养和分离合适产酶微生物的问题。壳聚糖具有良好的溶解性、生物相容性和可降解性，但不适合热机械加工。例如，从海洋来源提取壳聚糖的化学过程中，甲壳类动物的外骨骼需经过脱钙、脱蛋白和脱色步骤以产生甲壳素，随后用浓碱溶液（通常为 40 - 50% NaOH）处理以去除乙酰基并获得壳聚糖，但该过程需要高能量输入并产生有害化学废液。
糖胺聚糖：是线性多糖，通常作为蛋白聚糖的一部分存在，包括透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素等。透明质酸是一种长而无分支的非硫酸化多糖，负电荷高、亲水性强，在高分子量时形成粘性网络；硫酸软骨素是一种均聚糖胺聚糖，由重复的二糖单位组成；硫酸皮肤素的化学组成与硫酸软骨素相同，但部分葡萄糖醛酸残基发生表异构化形成艾杜糖醛酸。
提取糖胺聚糖的方法通常包括水解步骤，以从蛋白质核心中释放出糖胺聚糖。例如，糖胺聚糖通常作为蛋白聚糖的一部分存在于动物的细胞外基质中，其提取过程中，动物或鱼类组织材料首先需用合适的蛋白酶水解，以从蛋白质核心中释放出糖胺聚糖。
海藻酸盐：是一种可食用的线性阴离子杂多糖，由 1,4-β-D-甘露糖醛酸和1,4α-L-古洛糖醛酸残基组成，化学结构如下图所示。
在海洋环境中广泛存在于褐藻中，具有高凝胶形成特性，在食品、纺织和生物医学等领域有广泛应用。提取海藻酸盐需要先用矿物酸处理褐藻，将海藻酸钙盐转化为游离海藻酸，然后中和形成可溶性海藻酸钠，再通过沉淀和转化得到海藻酸钠。
例如，在提取海藻酸盐时，先用矿物酸处理褐藻，使其盐转化为游离海藻酸，然后通过中和形成可溶性海藻酸钠，随后沉淀为钙海藻酸盐纤维或海藻酸凝胶，最后通过处理转化为钠海藻酸钠。
角叉菜胶：是一种水溶性阴离子硫酸化多糖，存在于海洋红藻中，由交替的3-O-取代的β-D-半乳糖吡喃糖基单元和 4-O-取代的α-D-半乳糖吡喃糖基单元组成。最常用的角叉菜胶是 Kappa（κ）-、Iota（ι）-和 Lambda（λ）-角叉菜胶，它们具有良好的稳定性和凝胶形成特性。提取角叉菜胶通常包括干燥、水洗、碱水解和澄清干燥等步骤，温度、pH 和过程持续时间等因素会影响提取过程。例如，工业上常用的角叉菜胶包括 Kappa、Iota 和 Lambda 三种，具有不同的酯 - 硫酸盐基团数量和凝胶形成特性。
（二）蛋白质类海洋衍生生物材料
胶原蛋白：是最丰富的动物蛋白质，在细胞外基质和结缔组织中占主导地位，其化学结构特征是每条胶原链含有重复的氨基酸基序（Gly - X - Y）。
渔业加工副产品和废物中含有大量的 Type I 胶原蛋白，提取胶原蛋白需要经过预处理、提取和进一步纯化等步骤，常用的方法包括化学水解（使用酸、碱或盐溶解）以及结合物理（超声或微波）和/或酶促（蛋白酶）过程来增强提取效果。
例如，胶原蛋白在细胞外基质和结缔组织中起着重要作用，其提取过程中，通常先进行预处理以去除脂肪、非胶原蛋白和部分水解胶原蛋白交联，然后进行胶原蛋白提取和进一步纯化。
明胶：是一种天然蛋白质聚合物，由胶原蛋白通过水解降解产生，涉及胶原蛋白多肽链之间的交联断裂和部分多肽键的裂解。Type I明胶来源于Type I胶原蛋白，其水解产物包括分离或连接的α1-和α2-链，形成不同的多肽链组合。
明胶的提取过程包括预处理、酸或碱处理以部分裂解胶原蛋白交联，以及一系列连续的水热提取、浓缩、过滤、灭菌和干燥等步骤。根据处理所用的酸或碱的不同，明胶可分为A 型（酸性处理）和B型（碱性处理）。
例如，明胶的提取过程中，在预处理步骤去除脂肪、非胶原蛋白和其他杂质后，材料用酸或碱处理以部分裂解胶原蛋白交联，然后通过一系列连续的水热提取在增加的温度下进行，所得的水明胶溶液通过蒸发连续浓缩，然后过滤、灭菌和干燥。
四、结论和未来展望
（一）结论
3D 生物打印在生物医学和制药领域取得了显著进展，但使用海洋衍生生物材料的生物墨水仍面临一些挑战，如形成结构稳定物体的能力有限和分辨率有限等。
（二）未来展望
未来的研究需要关注增强生物墨水的机械和生物特性，提高打印分辨率。海藻酸盐、胶原蛋白和明胶在生物墨水开发中具有广阔前景。
综上所述，本文全面介绍了 3D 生物打印技术、海洋衍生生物材料在生物墨水配方中的应用、当前发展和挑战以及机器学习在该领域的应用，为未来的研究和发展提供了有价值的参考。
参考文献：
Khiari Z. Recent Developments in Bio-Ink Formulations Using Marine-Derived Biomaterials for Three-Dimensional (3D) Bioprinting. Mar Drugs. 2024 Mar 16;22(3):134.
