飞虎队解散后，美国陆军又从本土抽调飞行员和地勤人员来到中国，在原飞虎队的基础上组建第23大队，它与第16战斗机中队共同组建美国空军驻华特遣队，由转入现役并晋升准将的陈纳德担任特遣队指挥官，隶属于美军第10航空队。
1942年10月，军事委员会获得情报，日寇在香港囤积了大量作战物资，有可能会在近期对湖南、贵州和云南地区发动进攻。鉴于国军在华南地区兵力空虚，蒋介石以东南亚战区最高统帅的身份命令美国空军驻华特遣队出动，击毁日寇在香港囤积的作战物资，粉碎日寇进犯华南的企图。
陈纳德对这项任务十分为难，由于日寇已经切断了中国战区最后的陆上补给通道滇缅公路，而驼峰航线还处在探索阶段，新成立的特遣队实力十分有限。他手上能够投入作战的飞机只有12架B-25轰炸机和12架P-40战斗机。而特遣队的对手是日寇第33飞行战队，该战队拥有作战飞机近百架。
这次空袭的风险极大，特遣队实力处于绝对劣势，稍有不慎则可能在空战中全军覆没。陈纳德在和自己的幕僚仔细讲究飞行路线后，制定了“错肩”计划。要旨是特遣从桂林机场出发，在行动前向外泄露消息，让日寇通过情报部门获悉特遣队将空袭广州。之所以这样做，是因为从桂林、广州和香港几乎处在一条直线上，特遣队的欺骗行动不仅不会影响轰炸香港，更重要的是可以将日寇第33飞行队的飞机调到广州上空。
此后，特遣队对外宣称驻广州的第33飞行队是最大的敌人，美军航空特遣队随时准备出击，将它们消灭在地面。日寇很快通过渗透到后方的情报人员那里获悉了此事，遂加强了广州的防空力量。1942年10月25日，10架轰炸机在12架战斗机的护航下从昆明机场起飞，在桂林机场降落加油后，继续向东南方向飞行。
美军飞机从昆明出发不久，日寇的情报人员就已经将情报送出，驻守在香港的日寇第33飞行队第3中队立即赶往广州，准备与其他中队一同迎击来袭的美军特遣队。由于雷达技术落后，日寇无法跟踪美军飞机的动向，他们只能提前升空等待美军飞机。
当特遣队的22架飞机绕过广州，出现在香港的上空时，驻扎在这里的防空部队处于极度松懈的状态。当第一枚炸弹落下后，高炮部队才开始回击。10架轰炸机在5000米高空对停泊在维多利亚港的日寇军舰实施了空袭。据美军飞行员报告，轰炸十分成功，码头上囤积的大量弹药几乎全部被引爆，整个码头足足瘫痪了半个月。更大的战果是日寇在香港的油料库也被击中，数十万加仑的油料付之一炬。
1942年11月23日，陈纳德的特遣队再次出击，这次的作战目的是继续打击日寇第33飞行战队，以消除他们的报复企图。当天12架轰炸机在16架战斗机的护航下起飞，在桂林加油后又继续向东南方向飞去。日寇判断陈纳德此次的目标仍然是香港，遂提前做了相应的准备。然而让他们没有想到的是，陈纳德此次的目标是广州。驻留在广州天河机场的第33飞行队和临时转场的第25飞行队的大批飞机都没有来得及升空，就消灭在机场跑道上。日寇还付出了60名飞行伤亡的代价。
1943年3月10日，美国驻华空军特遣队扩编为第14航空队，继续由陈纳德指挥，并晋升他为少将军衔。其所辖第23大队和第308轰炸中队驻守在桂林，负责支援中国军队作战。航空队的另一项任务是负责通过驼峰航线运送物资。
驼峰航线全长800多公里，横跨喜马拉雅山脉，沿线山地海拔均在4500—5500米左右，最高海拔达7000米。航线从印度阿萨姆邦，经缅甸到中国昆明、重庆。运输机飞越青藏高原、云贵高原的山峰时，达不到必需高度，只能在峡谷中穿行，飞行路线起伏犹如驼峰，“驼峰航线”由此得名。
“驼峰航线”途经高山雪峰、峡谷冰川和热带丛林、寒带原始森林，以及日军占领区；加之这一地区气候十分恶劣，强气流、低气压和冰雹、霜冻，使飞机在飞行中随时面临坠毁和撞山的危险，飞机失事率高得惊人。有飞行员回忆：在天气晴朗的时候，我们完全可以沿着战友坠机碎片的反光飞行。他们给这条撒着战友飞机残骸的山谷取了个金属般冰冷的名字“铝谷”。因此，“驼峰航线”又称为“死亡航线”。
这种运输方式的代价是巨大的，运输一次资源和运输过程途中所消耗的资源形成严重的比例反差，而且一旦出现飞机事故，则损失更大。为了重新打通滇缅公路开辟地面运输通道，航空队还担任运输作战人员的任务，将中国的作战部队，经过运输，送至当时印度进行军事训练，再联合当时国内作战部队，同时出击，反攻日军，恢复失地，打通滇缅公路。
在这条航线上，中美双方3年多共向中国战场运送了70万吨急需物资，人员33477人，航空队共损失563架飞机，牺牲1500多人以及诸多失踪机组人员。如果加上中国航空公司所损失的飞机和飞行员，这个数字将会更加巨大。虽然牺牲巨大，但是航线的开通意义重大，是继滇缅公路暂时性的断绝之后的又一重要运输线，成为当时维持抗战的空中生命线。
1943年7月，在罗斯福的建议下，陈纳德担任盟军中国战区空军参谋长，以示对他过去工作的肯定。此后，第14航空队的规模不断扩大，作战范围扩展到西起缅甸、东至华南沿海、北抵长江、南至北回归线。
由于力量的壮大，第14航空队也改变了以前的游击战术，转为“高度专长的攻击”方式，重点对敌机和运输舰船实施打击。
1943年8月，陈纳德将第14航空队战斗部队主力派驻芷江，即调P-40战斗机54架，B-25中型轰炸机27架，P-38高空侦察机两架，以及C-46大型运输机进入芷江机场。
芷江机场是抗日战争时期，根据陈纳德提出的“在西南各省多建几处大型机场”的战略要求建立的重要空军基地。机场位于县城东南一公里处，占地4282亩，其中机场坪占地1955亩，跑道长1800米，宽70米，是航空委员会动员毗邻11县民工19000余人加速扩建的。
中美空军混合作战司令部设在机场北端公路旁原芷江接官亭旧址。第14航空队进驻芷江后，机场方圆5公里内山坳田间，建筑物鳞次栉比，扩建迅速，一批鱼鳞板式的黑色小平房拔地而起，变成密集型的乡场，民众称为“美国街”。中美空军混合大队、航空第九总站、防空指挥部、导航台、中美空军俱乐部、飞机修理第二厂、仓库、医院、油弹库、汽车队、转运所、养场队、招待所等遍布机场附近。
中美空军进驻芷江后，陈纳德将驻芷中美空军的作战区域明确划定为：在华中特别是黄河以南、平汉铁路以西地区，除负责夺取华中地区制空权、空战歼敌外，还担负着对日寇控制的粤汉、湘桂等铁路、公路运输线及长江、湘江、洞庭湖等处水路运输的轰炸和封锁，切断日军后方补给，阻滞其南下、西进，支援国军地面部队作战。为便于作战指挥，陈纳德将司令部分设于昆明、芷江两地，经常穿梭于昆明和芷江之间指挥战斗。
1944年4月起，日寇发起旨在打通大陆交通线的粤湘桂会战。8月，衡阳失守，从衡阳机场撤出的B-29轰炸机也集中到芷江机场。1944年底，桂林和柳州相继沦陷，第14航空队连续丧失了多处空军基地。柳州失守的第4天，11月15日，第14航空队从芷江起飞，直飞到400公里的衡阳上空，击毁在地面上的一整队30架日本战斗机和12架轰炸机。从此以后，日军再也没有使用衡阳基地进行过军事行动。
作为中美空军的秘密前进基地，芷江机场四周群山环绕，远离京广铁路，十分隐蔽。日寇一直不知道芷江机场的存在，在夺取平汉铁路和粤汉铁路沿线各机场后，中美空军仍然会轰炸己方重要目标。直到1945年初，日寇才获悉中美在芷江的机场。
1945年1月29日，侵华日寇总司令冈村宁次召开军事会议，确定夺取芷江机场的作战目标。命令第20军发起湘西会战。在判明日寇的企图后，军事委员会命令完成改编的第3和第4方面军保卫芷江，并伺机对日寇实施反击。同时命令陈纳德坐镇芷江，亲自指挥所部400余架飞机一同参加芷江保卫战。
陈纳德从昆明抵达芷江后，建议将缅北作战的新编第6军空运至芷江，担任战役总预备队。同时，他向与会的将领承诺，中美联合空军将在空中架设一条运输线，全力保障前线部队的作战补给，并给地面部队提供足够的空中火力支援。
1945年4月初至5月底，驻芷江的空军控制了整个湖南制空权。后来增援的两架代号为“黑寡妇”的神秘飞机，由于装有远程红外线雷达和对空导弹，日机再不敢夜袭芷江。4月10日，湘西会战第二天，芷江机场出动大批飞机，彻底破坏日军后援地衡阳、邵阳、湘潭三角地带大小桥梁。20日，轮番轰炸放洞、红岩大庙、大黄沙，1450高地等日军据点。轰炸长沙、衡阳、冷水滩日军机场。
5月1日，中美空军混合团对洞口来犯两个联队日寇连续实施一个星期轰炸。5月8日拂晓，芷江机场的飞机倾巢出动，在战场上空盘旋、扫射、轰炸。5月15日，又以高度爆炸弹、伞弹，液体燃烧弹，对洞口、雪峰山地带进行地毯式轰炸，重创日寇，迫使溃退。从4月10日至5月23日，中美空军共出动P-40、P-51战斗机2500架次，投弹100多万磅，发射机枪弹80多万发，湘西战役也是抗战正面战场为数不多的彻底胜利。
就在抗战即将胜利的前夕，陈纳德于1945年7月6日主动向美国航空兵司令阿诺德递交了辞呈，并获得了阿诺德的批准。陈纳德的这一举动让很多人非常不解，他自抗战全面爆发前夕就来到中国，在8年抗战期间，他几乎所有的时间都待在中国，并立志将日寇赶走。
他之所以选择提前离开，是因为他与美军高层的矛盾已经越来越深。尤其是他与同样跟中国有很深渊源的史迪威将军长期不和，后者痛恨国民政府的腐败，与蒋介石矛盾尖锐，还怀有强烈地控制中国所有军队的欲望。而陈纳德则非常尊重蒋介石，两人的关系在过去的8年中一直都十分融洽。
1944年底，蒋介石和史迪威摊牌，罗斯福出于全局利益的需要将史迪威调回国内。而军内的马歇尔、阿诺德等人则替史迪威鸣不平，最后将愤怒发泄到陈纳德身上。在此情况下，陈纳德不得不选择提前离开。
为了表彰陈纳德为中国抗战做出的贡献，国民政府给予了他极高的荣誉。蒋介石亲自为时年54岁的陈纳德授予一枚天青色一级宝鼎大勋章，并将昆明市区通往巫家坝机场的路更名为“陈纳德路”。市民自发赠送了陈纳德一万余件礼物，国民政府也赠送给他一把金钥匙，寓意中国将永远为他敞开大门。
1945年8月2日晚6时，陈纳德乘坐吉普车前往重庆解放碑（当时称新运广场）、参加专门为他准备的欢送仪式，沿途受到数万市民的欢送。由于送行的人太多，汽车已经无法前行，直到晚上8时仍然被欢送的人员簇拥在去往解放碑的路上。后来市民所幸抬起吉普车将其送到会场。
此情此景让陈纳德极为感动，他眼含热泪，用四川方言反复念叨“顶好”作为回应。在此前蒋介石夫妇为其专门举办的欢送宴会上，他深情地表示：“伟大的中国人民对我们表示友好，这令人难忘。我在这里度过了8年，极大地丰富了我的精神生活，同时使我加深了对这个国家的了解，我们将把这美好的记忆，长久地带给我们的后代子孙。”
陈纳德指挥的第14航空队在成立的2年多时间里，共击毁敌机2600多架，击沉日寇舰船441艘，歼敌6.67万人。其对日寇后方运输线的破坏，导致其控制的平汉线、津浦线只能运输所需最低限度25%的物资。而第14航空队付出的代价不到500架飞机。
二战结束后，陈纳德以私人身份于1945年12月返回中国。他在中国筹建了“民用航空公司”，后来改为“行政院救济总署空运大队”，帮助国民政府运输军队、武器投入内战。其间他还参与走私贩毒，从中牟取暴利，这成为他在中国期间的污点。
1947年，他与在美国的妻子离婚，迎娶年仅19岁的陈香梅女士为妻，二人育有两子。国民政府败退台湾后，他也跟随去台。1957年，陈纳德身体查出有癌细胞。1957年8月1日，在华盛顿举行的空军五十年庆祝大会上，陈纳德入选美国十大空军领袖。1958年7月18日，艾森豪威尔总统和美国国会批准晋升陈纳德为中将。27日，陈纳德因患肺癌在新奥尔良医院去世。美国国防部将其安葬于华盛顿阿灵顿军人公墓。在墓碑的背面用中文刻写着：陈纳德将军之墓。
据陈纳德在抗战期间写给家人的信件中统计，他在抗战期间多次驾机升空与日寇作战，在8年中他累计击落日机41架。这一数字无法得到确认，如果属实，他才是美军的头号王牌飞行员。
