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由于对多重耐药（MDR）细菌无效和复杂的氧化伤口微环境，伤口愈合和感染仍然是重大挑战。此外，感染的伤口会产生过量的活性氧（ROS），导致促炎细胞因子的释放，造成不可修复的细胞损伤、持续炎症并阻碍伤口愈合。

针对此问题，来自上海交通大学医学附属瑞金医院的卢敏＆Qiang Yu＆Li Wei＆Huizhen Fan＆Gang Zhao/上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科的Shen Wang＆李铭/东华大学材料学院的余诺＆Hanqing Li/同济大学医学院附属上海市第十人民医院的Guanghua Lu等人开发了百里醌增强的可注射热敏TQ@PEG-PAF-Cur水凝胶，具有微环境重塑和光动力治疗的双重功能。该水凝胶由天然化合物百里醌（TQ）和与天然光敏剂姜黄素（Cur）缀合的聚（乙二醇）-嵌段聚（丙氨酸-苯丙氨酸）共聚物（PEG-PAF）组成（图1）。TQ@PEG-PAF-Cur水凝胶可加快伤口覆盖，通过光激发消除MDR细菌，重塑伤口微环境，并加速伤口愈合。

相关研究成果以“Herbal Products-powered Thermosensitive Hydrogel with Phototherapy and Microenvironment Reconstruction for Accelerating Multidrug-resistant Bacteria-infected Wound Healing”为题于2024年2月28日发表在《Advanced Healthcare Materials》上。

图1 TQ@PEG–PAF–Cur水凝胶的制备

1. TQ@PEG-PAF-Cur水凝胶的合成和表征

TQ@PEG-PAF-Cur水凝胶的合成如图1A和图1B所示，由PEG-PAF、TQ和Cur的三嵌段共聚物组成。此外，将Cur掺入水凝胶中可以增强其光敏特性，从而增强抗菌、抗炎和抗氧化作用。通过透射电子显微镜（TEM，图2A）和动态光散射（图2B）研究了水凝胶的粒径，显示尺寸范围为38 nm至72 nm，平均尺寸约为 56 nm。随后，使用FTIR和液体核磁共振氢谱证明了材料的成功复合。

作者进一步研究了水凝胶的光学性质和热敏性能。PEG-PAF-Cur在 420 nm 处表现出归因于Cur的吸收带（图2F）。TQ@PEG-PAF-Cur在约280 nm和420 nm处显示分别源自TQ和Cur的吸收带。通过将温度从25 °C升高至35 °C来实现热敏凝胶效应（图2J）的研究表明其具有可注射性能。TQ@PEG-PAF-Cur的复合温敏水凝胶在皮肤表面具有良好的凝胶形成特性（图2K）。为了进一步探索水凝胶的分子结构和能级，使用Gaussian 09软件模拟证实了水凝胶系统内存在水凝胶键合，强调了所设计的多功能热敏水凝胶的理论可行性（图2D-E）。

图2 TQ@PEG–PAF–Cur 水凝胶的表征

2. TQ@PEG-PAF-Cur水凝胶的体外生物相容性

为了评估TQ@PEG-PAF-Cur水凝胶的生物相容性和增殖性，对L929细胞和HUVEC进行了表征。将水凝胶注射到小鼠体内一段时间，对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行研究，结果表明该水凝胶具有良好的生物相容性。通过活/死染色测定和细胞计数试剂盒（CCK-8）评估水凝胶的体外生物相容性。CCK-8测定也证实了水凝胶良好的生物相容性（图3A-B）。随后，以HUVEC细胞为模型，研究了水凝胶对内皮细胞增殖和血管生成行为的影响。结果表明，所有水凝胶变体中细胞增殖持续存在，与对照组相比，PEG-PAF-Cur 和TQ@PEG-PAF-Cur在增强细胞增殖方面表现出显着的有效性(图3C-D)。

图3 体外细胞相容性

接着，为了评估水凝胶对成纤维细胞生物学行为的影响，对L929细胞进行划痕测定。TQ@PEG-PAF-Cur中的平均迁移细胞数分别比对照、PEG-PAF和PEG-PAF-Cur中的平均迁移细胞数高4.7倍、1.8倍和1.2倍（图4B）。为了进一步评估L929细胞和HUVEC细胞的复合水凝胶形态和胶原分泌，进行了免疫荧光染色。结果表明，与PEG-PAF-Cur和对照组细胞相比，TQ@PEG-PAF-Cur组中的L929和HUVEC细胞分泌更多的Col I（图4C-D）。

图4 L929和HUVEC成纤维细胞的迁移测定

3. 体外抗菌功效

在这项研究中，作者通过形态学表征、细菌菌落定量和活/死染色测定等分析来评估这些水凝胶的抗菌功效。采用扫描电镜观察不同处理后耐药ESBL大肠杆菌和MRSA的形态变化。与对照组细菌的正常形态相比，经水凝胶处理并暴露于405 nm蓝光照射后，ESBL大肠杆菌和MRSA组的细菌细胞壁被破坏并起皱，这可归因于产生光动力疗法诱导的ROS（图5A和5D）。在各种治疗方法中，TQ@PEG-PAF-Cur内的细菌细胞膜受到最广泛的损伤，凸显了其卓越的抗菌效果。此外，细菌菌落定量支持以下发现：与对照组相比，水凝胶在暴露于光照射后有效地实现了ESBL大肠杆菌和 MRSA 细菌的完全灭菌（图5B和5E）。

图5 抗菌性能和体内ROS产生

4. 体内抗菌功效和伤口愈合

基于其良好的生物相容性和良好的体外抗菌活性，作者进一步利用感染MRSA的小鼠伤口模型进行了体内实验。该模型是通过在背部皮肤上制造伤口并用生物发光MRSA菌株感染来建立的。用水凝胶溶液覆盖伤口并照射405 nm蓝光（图6A，图6K）。伤口内MRSA的发光强度可以作为抗菌效果的直接评估指标。在对照组中，发光强度增加，表明MRSA的存活率较高（图6B）。相反，光照射后水凝胶的发光强度逐渐降低。具体来说，TQ@PEG-PAF-Cur处理在光照3分钟后没有显示出生物发光的痕迹，这证实了TQ@PEG-PAF-Cur的高抗菌能力（图6C）。

图6D显示了愈合过程第0、7、14和21天的伤口状态。与其他组相比，感染细菌并用TQ@PEG-PAF-Cur 和光处理的伤口都表现出加速愈合。为了可视化结果，追踪了伤口的动态愈合过程，如图6D所示。与一般观察结果一致，伤口面积（图6E）和长度（图6F）的定量分析表明，TQ@PEG-PAF-Cur组的伤口闭合率最高。此外，第7天和第14天伤口组织的细菌在BHI琼脂平板上培养（图6H-6J）。TQ@PEG-PAF-Cur组的细菌数量远低于对照、PEG-PAF@TQ、PEG-PAF-Cur组，表明TQ@PEG-Cur具有良好的体内抗感染活性。

图6 MRSA感染伤口愈合体内研究

为了评估组织学状态，对伤口标本进行了H&E染色测定（图7）。结果发现，TQ@PEG-PAF-Cur和PEG-PAF-Cur组的伤口出现上皮化和肉芽组织形成，而TQ@PAF-PAF和对照组的伤口愈合相对延迟。总体而言，TQ@PEG-PAF-Cur 组显示出恢复趋势改善最大的趋势，与其他组相比，第21天TQ@PEG-PAF-Cur组观察到新的肉芽组织、复杂的表皮结构和皮肤样附属物。

图7 伤口组织的组织学检查和免疫组织化学染色

综上，百里醌（TQ）增强的热敏水凝胶具有诱导光疗和重塑微环境以加速伤口愈合的能力。可注射水凝胶（TQ@PEG-PAF-Cur）由TQ和与姜黄素（Cur）缀合的聚（乙二醇）-嵌段-聚（丙氨酸-苯丙氨酸）共聚物（PEG-PAF）组成。TQ@PEG-PAF-Cur在蓝光激发下产生大量ROS，表现出快速高效的抗菌能力。此外，水凝胶可以发挥抗氧化活性，可以逆转氧化的伤口微环境。TQ@PEG-PAF-Cur不仅抑制促炎细胞因子的表达，还促进胶原蛋白的生成和血管生成。因此，TQ@PEG-PAF-Cur 水凝胶可加速体内伤口愈合。