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由自然进化而来的生物体是生物材料的杰出原料。这些实体可以赋予最终材料增强的功能，而其他方法无法达到。然而，在材料制备过程中保持这些原料单元的生物活性功能仍然是一个巨大的挑战。

来自加拿大麦克马斯特大学的Tohid F. Didar和Zeinab Hosseinidoust团队开发了一种高通量的自下而上自组装方案，用于将高浓度噬菌体组装成微凝胶，同时保持和放大其固有的抗菌活性和生物功能。每个微凝胶由50万个交联噬菌体作为唯一的结构组分组成，自组织成排列整齐的束状结构。本研究探究了制备过程中常见的问题，并描述了优化过程，以确保噬菌体构建模块的生物功能得以保留。该方案可用于制备含有制造的噬菌体微凝胶的抗菌喷雾，其中装载了有效降低红肉和新鲜农产品上高负荷多重耐药性大肠杆菌O157:H7的强毒性噬菌体。与其他微凝胶制备方法相比，本研究的方案特别适用于生物材料，因为它不含有机溶剂和热。基础材料的台式制备，即模板用于铸造微凝胶的微孔膜和纯浓缩噬菌体悬液，分别需要3.5小时和5天。单次生产过程可以产生超过1,750,000个微凝胶，所需时间范围为2小时至2天，具体取决于交联化学反应的速率。我们预计，这一平台将解决与噬菌体的保存、保持和传递以及抗菌应用相关的瓶颈问题，扩大噬菌体在预防和控制细菌感染和污染物方面的应用。相关工作以题为“High-throughput fabrication of antimicrobial phage microgels and example applications in food decontamination”的文章发表在2024年2月27日的国际顶级期刊《Nature Protocols》。

【本文亮点】

• 详细介绍了如何使用可剥离微孔模板制备噬菌体微凝胶，同时保持噬菌体的生物活性，并将这些微凝胶作为抗菌喷雾来减少食品产品中的多重耐药细菌污染，这是它们潜在用途的一个例子。

• 噬菌体微凝胶比自由噬菌体更稳定，适于存储和传递，相比其他抗菌剂具有优势，能够选择性地针对不同细菌株进行作用。

1. 创新型研究内容

本研究描述了生物活性的噬菌体构建微凝胶的制备方法，包括噬菌体专属微凝胶和噬菌体-蛋白质混合微凝胶，其主要功能是杀灭耐药细菌（图1）。这些新开发的微凝胶具有良好的可修改性，可以适用于广泛的应用领域。该程序包括三个主要阶段（图1a）。在第一阶段中，提供了准备所需的两种基础材料的说明，即纯化和浓缩的噬菌体悬浮液作为主要的微凝胶构建单元，以及作为模板的聚苯乙烯蜂窝膜（图1b中的示意图和图2中的工作流程）。在第二阶段中，描述了噬菌体专属微凝胶和噬菌体-蛋白质混合微凝胶的高通量制备（图1c中的示意图和图3中的工作流程），随后对微凝胶的物理和生物学特性进行表征（图1d中的示意图和图4和图5中的结果）。最后，展示了将噬菌体构建的微凝胶以悬浮形式应用于食品产品中，作为对抗耐药性大肠杆菌O157:H7的强效抗菌喷雾剂（图6中的工作流程和结果）。基础材料的台式制备需要0.5小时用于模板，噬菌体悬浮液需要5天。单次生产可以产生超过1,750,000个微凝胶（直径：约25μm），并且需要2小时到2天（取决于交联化学的速度）。微凝胶的表征和应用需要额外的4天，使得整个方案的总时长为10-11天。所描述的方案可以方便地修改和扩展，以在其他情境中将任何特定于目标细菌菌株的溶菌噬菌体纳入其中，包括人类或动物疗法、医疗或食品准备表面消毒，或农业生物防治等领域。

图1 噬菌体构建的微凝胶的制备和应用概述

图2 制备PS蜂窝模板

图3 噬菌体构建微凝胶的制备

【由噬菌体构建的微凝胶具有高度有序的纳米结构】

在这两种基础材料构建的多样噬菌体微凝胶中，通过GA或EDC交联的噬菌体专属微凝胶在纳米尺度上展现出复杂的纤维图案（图4a）。扫描电子显微镜图像显示微凝胶中的纳米纤维以单一方向排列，并由宽度在7至20纳米之间的纤维组成。纳米纤维结构可以用作质量控制，以验证微凝胶完全由在方案的第39步中制备的纯化M13纳米螺旋噬菌体构成。当将蛋白质（BSA）添加到微凝胶配方中时，噬菌体-蛋白质混合微凝胶中的纤维状纳米结构消失。相反，这些混合微凝胶在纳米尺度上具有粗糙的不规则表面纹理（图4a）。虽然蛋白质的引入破坏了通过GA或EDC交联反应使M13噬菌体有序排列的结构，但它可以增强凝胶的机械强度，并进一步保持噬菌体的生物活性和感染性。通过改变配方，可以进一步将其他噬菌体、小分子或生物制剂加载到噬菌体构建的微凝胶中，使其成为优秀的生物制剂传递平台。

【噬菌体构建的微凝胶具有可调节的尺寸和荧光性质】

除了纳米纤维表面纹理外，不同的配方会导致微凝胶的荧光信号变化，这可以针对不同的应用场景进行优化（图4b）。本研究用GA交联的噬菌体微凝胶在蓝、绿、橙和红色通道中显示出显著的自发荧光。这是由交联反应中碳氮双键内的电子跃迁引起的。GA交联剂组成的微凝胶在蓝色通道观察到的荧光信号最弱，而在橙色通道观察到的信号最强。相比之下，用EDC制备的噬菌体微凝胶与GA交联的微凝胶相比，自发荧光显著减弱。这是由于噬菌体和EDC之间的酰胺键产生的荧光信号较弱，与噬菌体和GA之间形成的希夫碱基相比25。将BSA纳入配方可以增强微凝胶的荧光信号（图4b）。如果不需要荧光，则应使用EDC交联噬菌体微凝胶以减弱信号。制备技术的可调节性使得可以生成高荧光和低荧光微凝胶，扩展了该平台技术的应用范围。

图4 噬菌体构建微凝胶的表征

【噬菌体构建微凝胶的抗菌活性】

本研究将附着在模板贴片上的M13微凝胶阵列和悬浮在水中以喷雾形式施用的M13微凝胶进行了抗菌测试（图5a）。在没有有效负载的情况下，这些微凝胶对目标细菌没有显示出感染性。这归因于M13的低基线活性以及交联诱导的干扰。有趣的是，在M13微凝胶中添加BSA后，观察到了与膜片和喷雾形式对应的感染性，分别针对大肠杆菌ER2738宿主的裂解区和斑点。假设是BSA上存在丰富的功能基团，减少了组成噬菌体的交联作用，从而增加了活性。虽然观察到的活性对于生物控制来说是不足的，但M13被认为是噬菌体微凝胶制备中的有价值工具，因为其纳米纤维结构具有高功能剂的负载能力。因此，溶菌噬菌体HER262和T7被添加到微凝胶中形成M13 + HER262 + BSA + GA和M13 + T7 + BSA + GA微凝胶。在膜片和喷雾形式下，这些微凝胶对大肠杆菌O157:H7（HER262的宿主）和大肠杆菌BL21（T7的宿主）表现出强烈的抗菌活性（图5b、c）。

为了更好地量化它们的抗菌活性，M13 + HER262 + BSA + GA微凝胶随后直接施用于不同的大肠杆菌测试溶液。当与非宿主菌株大肠杆菌ER2738或大肠杆菌BL21一起孵育时，微凝胶对细菌生长没有明显影响（图5d、e）。与营养不足的大肠杆菌O157:H7溶液孵育显示，在浓度低于107个菌落形成单位（c.f.u. mL-1）时，9小时内可以根除宿主细菌（图5f）。在108个c.f.u. mL-1的浓度下，观察到了六个数量级的减少。与富含营养的大肠杆菌O157:H7溶液孵育也显示出了对细菌生长的迅速抑制作用。与对照相比，与微凝胶一起处理的细菌溶液中，在4小时内观察到了受限制的细菌生长（图5g）。在9小时后的定量分析显示，无论初始细菌负载如何，与微凝胶一起处理的富含营养的大肠杆菌O157:H7溶液的最终浓度在107和106个c.f.u. mL-1之间。相比之下，对照样本的浓度都增长到了109个c.f.u. mL-1（图5h）。然后，使用M13 + T7 + BSA + GA微凝胶进行了类似的测试，营养不足条件下，在大肠杆菌BL21浓度低于106个c.f.u. mL-1时，9小时内完全根除，较高浓度下观察到六个数量级的减少（图5i）。在富含营养的条件下，细菌生长在约1小时内停止了（图5j）。在9小时后的定量分析显示，与微凝胶结合后，大肠杆菌BL21的最终负载为104个c.f.u. mL-1，而对照样本的浓度为108个c.f.u. mL-1（图5k）。在此期间，T7噬菌体滴度从10个p.f.u. mL-1增长到109个p.f.u. mL-1（图5l）。

图5 评估噬菌体微凝胶的杀菌能力

【噬菌体微凝胶喷雾的食品除菌测试】

本研究对污染的食品产品进行了混合噬菌体微凝胶的抗菌活性评估（图6a）。未经处理的莴苣叶（模拟营养不足的食物基质），在9小时内大肠杆菌O157:H7的细菌浓度从每克106个菌落形成单位（c.f.u. g-1）增加到3.3×107 c.f.u. g-1（图6b）。然而，在经过9小时的微凝胶喷雾处理后，污染的莴苣叶上的细菌负载不可检测（少于100 c.f.u. g-1，或降低六个数量级）。类似地，未经任何干预的牛肉样品（模拟富含营养的食物基质），在9小时内大肠杆菌O157:H7的细菌浓度从每克106个c.f.u. g-1增加到2.5×108 c.f.u. g-1（图6b）。然而，在经过9小时的微凝胶喷雾处理后，牛肉样品上的细菌负载减少了99.94%，降至1.4×105 c.f.u. g-1（图6b）。莴苣和牛肉之间抗菌性能的差异部分归因于牛肉中的营养物质含量，促进了细菌的快速生长，部分归因于牛肉的纹理特性，对子代噬菌体的扩散具有更高的阻力。

图6 噬菌体微凝胶喷雾在食品除菌应用中的应用

2. 总结与展望

总之，这些结果表明：本研究制备噬菌体构建的微凝胶的方案具有高通量和可重复性。噬菌体构建的微凝胶可以在不同环境中有效地针对抗生素耐药性细菌。该平台具有灵活性，因为噬菌体可以通过化学和基因工程对壳蛋白进行修饰，通过合成生物学的不断进展，扩展了生物功能性。因此，利用各种经过工程改造的噬菌体，使用该方案构建微粒，可以建立一个多方面的生物材料和界面平台。噬菌体微凝胶的长期生物活性、耐久性和监管考虑需要在与预期应用相关的特定条件下进行进一步研究

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