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骨关节炎（OA）是一种以关节软骨逐渐退化为特征的慢性关节疾病。开发调养疾病的药物面临的一个挑战是如何有效地向软骨细胞输送药物。关节的独特结构促使药物通过滑液快速清除，而致密和无血管的软骨细胞外基质（ECM）限制了药物的渗透。
来自北京大学第三医院运动医学研究所的余家阔团队、来自中国科学院大学的聂广军团队与来自国家纳米科学中心的Ruifang Zhao团队合作发现了包覆在软骨细胞膜（CM-NPs）上的聚（乳酸-共聚乙醇酸）纳米颗粒与未包覆的纳米颗粒相比更容易被大鼠软骨细胞体内吸收。CM-NPs的内化主要由E-cadherin、clathrin介导的内吞作用和微蛋白细胞吞噬作用介导。这些CM-NPs附着在体内大鼠膝关节的软骨ECM上，并深入软骨基质，停留时间超过34天。模拟滑液清除研究表明，含有Wnt通路抑制剂adavivint（CM-NPs-Ada）的CM-NPs能延缓炎症条件下大鼠和人类软骨细胞及软骨外植体的分解代谢。在大鼠 OA 的手术模型中，药物负载的 CM-NPs 可有效恢复步态，减轻关节周围骨重塑，并提供软骨保护，防止软骨退化。在犬前十字韧带横断模型中，CM-NPs-Ada 也减轻了 OA 的发展。这些结果证明了使用软骨细胞膜包裹的纳米颗粒改善抗 OA 药物的药代动力学和疗效的可行性。相关工作以题为“Chondrocyte membrane–coated nanoparticles promote drug retention and halt cartilage damage in rat and canine osteoarthritis”的文章发表在2024年02月21日的国际顶级期刊《Science Translational Medicine》。
1. 创新型研究内容
骨关节炎（OA）缺乏有效的疾病改变疗法，部分原因是难以将药物输送到致密和无血管的软骨组织。Deng 等人用软骨细胞膜伪装载药纳米粒子，以增加纳米粒子与软骨的相互作用。这些膜包覆的纳米粒子保留了关键的软骨细胞蛋白，支持大鼠和人体软骨中细胞与基质的相互作用。这些纳米颗粒在体内大鼠膝关节中至少保留了 34 天。在大鼠和犬损伤诱导的 OA 模型中，这些纳米颗粒释放的 Wnt 通路抑制剂改善了软骨和软骨下骨的形态。这些研究结果支持进一步开发用于软骨给药和调养 OA 的仿软骨细胞颗粒。
【CM-NP 保留了原生 CM 的蛋白质特征】
原代关节软骨细胞是间充质来源的终末分化细胞，在长期培养或重复传代后往往会迅速失去分化表型。为了最大限度地减少向成纤维细胞的去分化，并获得质膜提取最佳表型的大鼠软骨细胞，本研究测定了培养传代对 I 型和 II 型胶原蛋白（COL）和凝集素（ACAN）特征表达的影响。在初代培养物（P0）中，Col2a1 和 Acan 的 mRNA 表达量很高，但随着传代次数的增加而逐渐降低（图 1A）。从第 2 代（P2）开始，几乎检测不到 Acan，而 Col1a 的表达从 P0 到 P5 没有变化，这表明连续培养会导致软骨细胞的再分化。为获得足够数量的细胞以分离质膜，所有后续实验均使用 P1 软骨细胞作为细胞膜来源。多角形的 P1 软骨细胞产生蛋白多糖和 COLII，阿尔新蓝染色和 COLII 免疫荧光证实了这一点（图 1B）。P1 软骨细胞还表达参与细胞基质或细胞-细胞相互作用的蛋白质，包括整合素成分 β1、α1、α3、αV、CD44、N-粘连蛋白和 E-粘连蛋白（图 1B 和图 S2）。这些膜蛋白的大量表达为随后分离出的 CM 与同型软骨细胞或软骨 ECM 的相互作用提供了基础。
通过细胞裂解和一系列差速离心提取 CMs。通过 400 纳米截面挤压机重复共挤膜，用 CMs 装饰预先制备好的 PLGA 纳米粒子核。为了探索完全包膜的最佳 PLGA 与膜蛋白重量比，本研究测试了从 40:1 到 5:4 的一系列核心与细胞膜的比率；结果表明， CM-NPs 的流体力学直径几乎保持不变，而当比率增加到 5:2 时，zeta 电位逐渐增加到大约 -23.60 mV。然而，随着细胞膜含量的进一步增加，粒径也随之增大，这表明添加物已经过量。CM 囊泡的透射电子显微镜（TEM）图像显示出直径约为 98.69 ± 8.71 nm 的圆形杯状结构，而 PLGA 与膜蛋白重量比为 5:2 的 CM-NPs 则显示出均匀的球形 PLGA 核心（69.14 ± 4.67 nm），被厚度约为 9.85 nm 的外膜壳包围（图 1C）。动态光散射（DLS）分析表明，CM-NPs 的平均直径（112.30 ± 0.78 nm）略大于未包覆的 PLGA 纳米粒子（P = 0.0004）（97.52 ± 1. 38 nm），CM-NPs 的表面电荷（-23.60 ± 0.30 mV）与 CM 囊泡的表面电荷（-23.03 ± 0.41 mV）相当，但比未包覆 PLGA 内核的表面电荷（-32.17 ± 0.95 mV；图 1D）的负电荷要少（P < 0.0001）。
图1 CM-NPs 可保留大鼠原代软骨细胞膜的蛋白质特征
【软骨细胞通过凝集素介导的内吞作用和微粒吞噬作用将 CM-NPs 内化】
本研究首先探究了膜包衣对纳米颗粒被软骨细胞摄取效率的影响，软骨细胞是与 OA 相关的生物学靶点。以红细胞（RBC）膜包被纳米颗粒（RM-NPs）为对照，本研究比较了大鼠软骨细胞对Cy5.5标记的未修饰PLGA-NPs、RM-NPs和CM-NPs共孵育1或5小时后的吸收情况。用 Cy5.5 标记的 CM-NPs 处理的软骨细胞显示出强烈的红色荧光（图 2A）。用 PLGA-NPs 培养的软骨细胞荧光较弱，这表明细胞膜涂层对软骨细胞靶向至关重要。软骨细胞对 RM-NPs 的吸收低于对 CM-NP 的吸收，这表明软骨细胞特异性膜蛋白促进了同型靶向。与这一观察结果一致的是，流式细胞仪定量分析显示，与 Cy5.5 标记的 CM-NPs 一起孵育后，软骨细胞的平均荧光强度明显高于 PLGA-NPs 和 RM-NPs（P < 0.001）（图 2B 和 C）。
接下来，本研究探究了CM装饰是否也会影响非同源细胞（如骨髓间充质干细胞（BMSCs）和巨噬细胞）对纳米颗粒的内化。与软骨细胞相比，骨髓间充质干细胞在孵育 1 小时后对三种纳米颗粒制剂的吸收相似，5 小时后对 CM-NPs 的吸收略有增加，这可能是由于软骨细胞和骨髓间充质干细胞的共同来源。(图2D 左侧）。此外，与 PLGA-NPs 相比，RM-NPs 和 CM-NPs 在 1 小时和 5 小时内的巨噬细胞摄取量都略有减少，这进一步突显了 CM-NPs 的软骨细胞特异性靶向能力（图 2D 右）。这一结果与之前的研究结果一致，即细胞膜涂层的存在会干扰巨噬细胞的清除，从而延长纳米颗粒的体内半衰期。
图2 原代软骨细胞通过凝集素介导的内吞作用和微粒吞噬作用吸收 CM-NPs
【软骨中的粘附、渗透和保留】
考虑到纳米颗粒在被软骨细胞内化之前必须能够扩散到软骨 ECM 中，本研究接下来探究了纳米颗粒与软骨 ECM 之间的相互作用。本研究首先利用模拟软骨组织的体外三维（3D）模型多细胞球体（MTS）研究了 CM-NPs 的软骨渗透性（图 3A 左）。将三种 Cy5.5 标记的制剂（PLGA-、RM- 或 CM-NPs）添加到大鼠软骨细胞 MTS 中，然后培养 12 小时，再使用 25μm的 Z 间隔的共聚焦显微镜 Z 叠成像。PLGA-NPs 和 RM-NPs 只定位在 MTS 的外层周围，而不在中心（图 3A 右）。相比之下，CM-NPs 可渗透到球体深处，在球体中心显示的荧光强度分别是 PLGA-NPs 或 RM-NPs 的 11.86 ± 3.57 倍或 7.86 ± 2.03 倍，这表明 CM-NPs 在体外软骨模型中可能具有特殊的渗透特性（P < 0.0001）（图 3B）。为了进一步证实这一发现，使用具有比 MTS 更难穿透的三维 ECM 结构的大鼠软骨外植体进行了相关实验。本研究从纳米尺度的角度研究了纳米颗粒与软骨 ECM 之间的相互作用。在与 CM-NPs 培养 12 小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗以模拟滑液清除，扫描电子显微镜（SEM）图像显示，大量 CM-NPs（是 PLGA-NPs 的 7.29 倍）吸附在大鼠软骨纤维网络上（P < 0.0001）（图 3C）。相比之下，加入 RM-NPs 时纳米颗粒的数量极少，这证实了 CM 涂层使纳米颗粒对软骨 ECM 具有更强的粘附能力。接下来，本研究用荧光标记的纳米颗粒培养外植体 3 天，然后切片并用共聚焦显微镜观察。本研究观察到大量的 CM-NPs 聚集在大鼠软骨表面，在软骨深层约 83.21 ± 18.34 μm 处分布清晰，而对照实验中的荧光信号仅出现在软骨表层区域（图 3D）。由于软骨诱导的 BMSC 膜是有前景的 CMs 替代品，本研究还观察到 CIBM-NPs 的粘附和渗透能力比 BM-NPs 更强。
图3 通过软骨粘附和渗透，CM-NPs 可延长关节保留时间
【软骨细胞和软骨外植体的调养效果】
Wnt 信号在 OA 关节组织中上调，并驱动软骨降解、软骨细胞肥大和炎症。鉴于 Wnt 信号在 OA 发病机制中的重要作用，药物调节 Wnt 信号通路为调养 OA 提供了一种前景广阔的方法。Adavivint（又名 SM04690 和 lorecivivint）是一种 Wnt 信号通路的小分子抑制剂，已被研究作为一种改善 OA 疾病的药物，最近已进入针对膝关节 OA 患者的 3 期临床试验（NCT03928184）。一旦被软骨细胞内化，它就会通过抑制 Wnt 靶基因的表达来调节 Wnt 信号通路。因此，本研究选择 adavivint 作为抗 OA 有效载荷模型，通过双乳液法将其载入 PLGA 核心，然后用软骨细胞膜或 RBC 膜修饰，得到载入 adavivint 的 CM-NPs 或 RMNPs（分别为 CM-NPs-Ada 或 RM-NPs-Ada）。药物负载率和封装效率分别约为 2.2% 和 55.4%（重量百分比）。两种制剂的 adavivint 体外释放动力学相似（图 4A）。在贮存稳定性研究中，CM-NPs 在添加 adavivint 之前和之后的性质在冻融循环和冻干后重新悬浮后几乎没有变化。当原代大鼠软骨细胞长时间体外暴露于游离 adavivint 或纳米颗粒时，即使浓度高达 2.56 μM（P < 0.0001），CM-NPs-Ada 也能显著降低细胞毒性，而游离 adavivint 在早期阶段就表现出典型的浓度依赖性毒性，这表明 CM-NPs-Ada 通过减缓负载 adavivint 的释放来降低毒性（图 4B）。
此外，本研究证实 CM-NPs 不会影响大鼠软骨细胞中分解代谢[基质金属蛋白酶 3（Mmp3）]或合成代谢（Col2a1）标记物的表达，这进一步证实了其理想的细胞相容性（P > 0.05）。为了评估 CMNPs-Ada 中装载的 adavivint 的生物活性，本研究接下来建立了一个体外试验，用白细胞介素-1β（IL-1β）处理大鼠或人类软骨细胞，IL-1β 会导致分解代谢的刺激和合成代谢的下调。首先用 CM-NPs-Ada 处理软骨细胞 2 小时，然后清洗并在补充了 IL-1β 的新鲜培养基中维持，以模拟滑液清除（图 4C）。与游离阿达维文特或 RM-NPs-Ada 相比，CM-NPs-Ada 能更有效地逆转 IL-1β 对大鼠和人类软骨细胞的影响，如降低 ECM mRNA（Col2a1 和 Acan）的表达和提高蛋白酶 mRNA（Mmp3 和 Adamts5）的表达（P＜0.05）（图 4D）。在另一项实验中，大鼠股骨头外植体在接受不同药物制剂处理 12 小时后与 IL-1β 培养 7 天或与人软骨培养 21 天（图 4C）。未经额外处理的 IL-1β 处理会导致外植体出现类似 OA 的表型，其特点是 ECM 大量流失。在游离抗生素组，大鼠和人类软骨样本中的黄樟素 O 和快绿素（SO&FG）染色（图 4E 和 F）和 COLII 的免疫组化染色显示出与单独使用 IL-1β 调养组相似的病理变化（图 4G 和 H）。
图4 CM-NPs-Ada 对软骨细胞和软骨外植体具有软骨保护作用
【减轻手术诱导的大鼠 OA 模型中的软骨退行性变】
OA 是一种影响整个关节的多因素慢性疾病。为了测试 CM-NPs-Ada 的体内调养潜力，本研究对大鼠的右后肢膝关节进行了前交叉韧带横断（ACLT）和部分内侧半月板切除术（pMMx）（图 5A，上图），这是一种通过手术诱导的啮齿动物 OA 模型。术后两天，将大鼠随机分为四组，分别接受 PBS、游离 adavivint、RM-NPs-Ada 或 CM-NPs-Ada 的关节内注射（图 5A，下图）。调养 4 周后，收集了爪压数据，以调查步态参数，这些参数反映了受影响关节的不稳定性和肌肉无力的严重程度。PBS 组显示右脚压力降低，游离 adavivint 组和 RMNPs-Ada 组的右脚压力同样较低。在 CM-NPs-Ada 组，观察到右脚和左脚之间的压力分布相似，与假足组相当（图 5B）。这些静态相对力分布结果与间歇平衡分析结果一致，在间歇平衡分析中记录的双脚压力值持续时间相等，这意味着 CM-NPs-Ada调养有效地减轻了骨关节炎膝关节的不稳定性和肌肉无力（图 5C）。在研究终点，还观察到 CM-NP-Ada 能有效降低 OA 大鼠对疼痛的敏感性，这是由热板试验中的反应时间来评估的（P = 0.0360）（图 5D）。
图5 CM-NPs-Ada 调养可减轻创伤后大鼠 OA 的发展
【CM-NPs-Ada 可减轻犬模型中 OA 的发展】
在 CM-NPs-Ada 对大鼠体内疗效的基础上，本研究使用临床前大型动物模型进一步评估其在犬模型中的性能，犬模型的软骨特性与人类更相似。雄性小猎犬接受了 ACLT 手术，术后 20 天每月用 PBS、RM-NPs-Ada 或 CM-NPsAda 调养一次受影响的关节（图 6A）。根据 OARSI 组织病理学倡议发布的犬 OA 评分系统，调养 5 个月后，未调养组和 RM-NPs-Ada 组的软骨损伤明显。相比之下，CM-NPs-Ada 组的软骨表面光滑（图 6B 和 C）。与之前的研究结果类似，最严重的 OA 主要发生在股骨髁前中部区域和胫骨平台的负重区域。在使用 PBS 或 RM-NPs-Ada 调养的犬 OA 模型中，显微 CT 成像显示股骨髁和胫骨平台外围的骨质增生明显增加（P < 0.001），而 CM-NPs-Ada 组仅有少量骨质增生（P = 0.4263）（图 6D 和 E）。
图6 在犬模型中，CM-NPs-Ada 可抵消前十字韧带横断（ACLT）诱发的 OA 病变
2. 总结与展望
本研究存在一些局限性。OA 也是一种多抗原炎症性疾病，软骨 ECM 片段的释放可能诱发先天性免疫反应，进一步恶化 OA 的发展（66）。这表明，通过抗原特异性进行免疫调节可能有助于对 OA 进行干预。因此，CM-NPs 表面的多种抗原是否能诱导抗原特异性耐受，特别是与雷帕霉素等免疫抑制剂联合使用，以改善 OA 关节的炎症，还需要在临床应用前进一步深入研究。此外，药物在软骨中的给药和运输动力学还取决于载体的大小；本研究只关注了 CM-NPs 的表面功能特性，而没有研究颗粒大小的影响。进一步优化粒径可能会对渗透性能有所帮助。此外，虽然在单次关节内注射后的第 34 天就观察到了关节内的荧光信号，但 adavivint 的释放动力学仅为 2 周左右。对更长的释放曲线进行微调可能会提高疗效。这项研究验证了 CM-NPs 作为基于纳米颗粒的药物储藏库的有效性，证明了其在软骨渗透、基质结合和软骨细胞吸收方面的功效。本研究团队设想，CM-NPs 还能为其他可改善 OA 疾病的候选药物提供临床载体。
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