*仅供医学专业人士阅读参考
点击右上方“关注”，准时接收每日精彩内容推送。
用单克隆抗体阻断细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）免疫检查点在癌症疗养方面具有巨大前景，但这些抗体会在正常器官中引起免疫相关不良反应。近日，来自美国芝加哥大学的Wenbin Lin和Ralph R. Weichselbaum教授团队进行了免疫原性双功能纳米颗粒抑制癌症和树突状细胞中细胞程序性死亡配体1，增强适应性和化学免疫疗养的相关研究。研究成果以“Immunogenic Bifunctional Nanoparticle Suppresses Programmed Cell Death-Ligand 1 in Cancer and Dendritic Cells to Enhance Adaptive Immunity and Chemo-Immunotherapy”为题于01月29日发表在《ACS Nano》上。
本文开发了一种由奥沙利铂（OxPt）和2-溴棕榈酸（BP）组成的细胞双靶向纳米配位聚合物（NCP）-OxPt/BP，通过抑制棕榈酰酰基转移酶DHHC3有效下调癌细胞和树突状细胞（DC）中PD-L1的表达。OxPt/BP通过增加细胞内氧化应激和增强OxPt诱导的刺激性免疫原性癌细胞死亡，有效促进DC成熟。OxPt/BP全身给药可促进细胞毒性T细胞浸润和活化，同时减少调节性T细胞数量，减少直肠癌的生长和浸润。综上结果，OxPt/BP能显著延长小鼠存活期，而不会产生明显副作用。NCP可同时重编程癌细胞和DCs实现癌症有效疗养。
本文从以下几个方面进行详细描述
1. OxPt/BP的制备和表征
2. OxPt/BP的药代动力学、生物分布和细胞免疫
3. OxPt/BP诱导氧化应激和免疫性细胞死亡
4. OxPt/BP促进DCs成熟
5. OxPt/BP可抑制DCs和癌细胞PD-L1表达
6. OxPt/BP可促进PBMC增殖和活性
7. OxPt/BP对小鼠CRC模型有很强的抗肿瘤作用
8. OxPt/BP增强抗肿瘤免疫力
9. OxPt/BP抑制CRC的生长和转移
图1 实验流程及机制示意图
本文开发了一种用于化学和适应性免疫疗法的双功能纳米配位聚合物（NCP）OxPt/BP。OxPt/BP由NCP内核中的奥沙利铂（OxPt）和核壳中的2-溴棕榈酸（BP）组成，可有效延长血液循环时间，增强肿瘤内蓄积，并通过BP介导的DHHC抑制作用，靶向癌细胞和DC，有效降低PD-L1的表达。OxPt/BP通过增加DCs细胞内氧化应激和增强OxPt诱导的癌细胞ICD促进DC成熟。因此，OxPt/BP大大促进细胞毒性T细胞的浸润和活性，并显著降低体内免疫抑制调节性T细胞的比例。以上作用使OxPt/BP能够在小鼠直肠癌（CRC）模型中显著抑制肿瘤生长，不会造成过多不良影响。
图2 OxPt/BP物理/化学特性和体内给药
核壳NCP纳米粒子OxPt/BP的制备分为两个步骤（如图2a所示）。OxPt/BP中OxPt和BP的负载量分别为0.7%和13.0%，两种药物的封装效率均为100%。OxPt/BP中OxPt与BP的比例保持为1:20。OxPt/BP大小均匀，为83.6±0.2nm，DLS测量的多分散指数（PDI）为0.18±0.02，透射电子显微镜（TEM）观察到其球形形态。OxPt/BP的zeta电位为-13.1±1.6mV，表面负电荷可延长血液循环时间。ZnP/BP、OxPt-NCP和OxPt/BP在各种培养基中均具有极佳稳定性，在37°C下培养48小时后粒径无明显变化。OxPt/BP培养48小时后，OxPt/BP在pH值为5.5的PBS中释放了81.3±7.6%的OxPt和82.4±6.0%的BP，在pH值为7.4的PBS中仅释放3.9±0.4%的OxPt和3.5±0.9%的BP。OxPt和BP的释放与pH值有关，主要由于OxPt/BP在酸性环境中分解的结果。对C57BL/6小鼠单次静脉注射OxPt/BP后药代动力学进行评估。游离OxPt和BP在30分钟内从血液中完全清除，在注射48小时后，血液循环中仍可检测到来自OxPt/BP的5.9%的OxPt和7.9%的BP。因此，将OxPt和BP制成NCP粒子后，其AUC 0→t值分别增加了125.3倍和110.6倍。小鼠在静脉注射后48小时处死，对肿瘤和主要器官测量OxPt和BP。与游离药物相比，OxPt/BP向肿瘤有效输送的OxPt是游离药物的7.6倍，BP是游离药物的10.2倍。进一步证实OxPt/BP在体内的出色稳定性。以上结果表明，OxPt/BP的血液循环时间长、肿瘤蓄积量高，而且具有双细胞靶向能力。
图3 OxPt/BP可降低癌细胞和DCs PD-L1的表达，促进T细胞的增殖和活性
PD-L1在DC（尤其是mDC）中过度表达会削弱T细胞启动和适应性免疫反应。ZnP/BP能有效下调脂多糖（LPS）诱导的mDCs膜PD-L1（mPD-L1）表达，WB分析也证实这种下调，BP可通过抑制棕榈酰酰基酰基转移酶DHHC3诱导的癌细胞中PD-L1的降解。为阐明ZnP/BP介导的PD-L1下调机制，通过WB评估DHHC3在mDCs中的表达。结果显示未成熟DCs（iDCs）中等水平表达DHHC3，mDCs则表现出与MC38细胞类似的高水平DHHC3表达。表明ZnP/BP可通过抑制DHHC3下调癌细胞和mDC中PD-L1。随后，研究人员使用DHHC3 siRNA（siDHHC3）敲除DHHC3，以研究DHHC3与mDCs中PD-L1的相关性。WB结果显示，DHHC3敲除导致mDCs中pPD-L1水平显著降低。此外，ZnP/BP在DHHC3敲除的mDC中不再影响pPD-L1的表达。这些结果表明，ZnP/BP通过抑制DHHC3来抑制mDC中PD-L1表达。尽管OxPt/BP处理诱导了更高比例的mDCs，但仍明显抑制mPD-L1水平，使其低于PBS对照组。同时，OxPt/BP使mCherryMC38细胞上mPD-L1表达量减少到OxPt-NCP处理的68.1%。这些结果表明，OxPt/BP可同时抑制PD-L1在DCs和癌细胞上的表达。DCs和癌细胞中PD-L1的过度表达会导致T细胞功能衰竭并限制适应性免疫反应。研究人员建立了一个包含MC38细胞、BMDCs和外周血单核细胞（PBMCs）的细胞共孵育系统，评估OxPt/BP对T细胞功能的影响。结果显示MC38细胞和BMDCs中PD-L1过度表达导致免疫抑制。OxPt/ BP显著增加PBMC增殖，主要原因在于抗原呈递显著增强，PD-L1表达减少。
图4 OxPt/BP疗养MC38肿瘤
接着，研究人员进一步分析了OxPt/BP对转移性CRC的抗肿瘤效果。将MC38细胞接种到盲肠粘膜下8天后，小鼠静脉注射PBS、OxPt、BP或OxPt/BP，每3天一次，共注射5次。生物发光显示，PBS组的MC38肿瘤生长快速并扩散到整个腹部，表明成功建立一个具有高度侵袭性的CRC模型。PBS组小鼠在第20天因肿瘤过重而安乐死。收集小鼠的胃肠道和器官进行体内外成像。结果显示PBS组、OxPt和BP组小鼠的肝、脾、肺、肾、胃、肠、结肠和直肠中都有许多肿瘤。与此相反，OxPt/BP组的五只小鼠中有四只在这些组织中没有肿瘤，另一只仅在大肠中有微小结节。原发肿瘤的TUNEL和Ki67染色显示，与OxPt、BP组相比，OxPt/BP能诱发更多细胞凋亡，有效减少细胞增殖。一项平行实验显示，OxPt/BP疗养将中位生存期从PBS的22天延长至48天。与PBS对照组相比，OxPt和BP组并未提高小鼠的中位生存期。总之，以上结果表明，OxPt/BP能有效疗养近似人类CRC的MC38肿瘤。
总结与展望
本文开发了一种双细胞靶向NCP纳米颗粒，通过抑制PD-L1在癌细胞和抗原呈递mDCs中的表达来增强免疫疗法。OxPt/BP可有效促进CTLs浸润，减少免疫抑制性Tregs数量，在小鼠模型中有效抑制肿瘤生长，且无明显不良反应。该纳米颗粒具有多样化学性能、高负载能力和内在生物降解性，为同时重编程癌细胞和DCs以实现有效肿瘤疗养提供一个前景广阔的平台。
了解更多
关注“EngineeringForLife”，了解更多前沿科研资讯~
