HNEpC 细胞(人鼻黏膜上皮细胞)的培养对于研究鼻腔相关的生理功能、疾病机制以及药物研发等具有重要意义。以下是一份详细的 HNEpC 细胞培养攻略。
一、培养前准备细胞来源与质量检测确保获取可靠来源的 HNEpC 细胞,可从正规的细胞库或经过验证的实验室获取。在收到细胞后,应立即进行细胞活力检测,如台盼蓝拒染法,以评估细胞的初始状态和存活率。一般来说,活细胞不会被台盼蓝染色,而死细胞会被染成蓝色。细胞存活率应在较高水平(通常 80% 以上)为宜,以保证后续培养的顺利进行。
培养器材与试剂准备准备合适的培养容器,如培养瓶或培养皿,需确保其无菌。常用的培养瓶规格有 25cm²、75cm² 等,可根据细胞培养的数量和实验需求选择。准备细胞培养基,HNEpC 细胞通常需要特定的上皮细胞培养基,其中可能包含多种营养成分,如必需氨基酸、维生素、无机盐等,以及一些生长因子如表皮生长因子(EGF)等,以支持细胞的生长和分化。此外,还需准备胎牛血清,一般血清添加比例为 5% - 10%,胎牛血清能为细胞提供丰富的营养和生长因子,但使用前需进行热灭活处理,以去除可能存在的补体等对细胞有影响的成分。同时,准备好胰蛋白酶或其他合适的消化酶,用于细胞的传代培养。还需准备无菌的 PBS 缓冲液,用于清洗细胞。
二、细胞培养操作细胞接种将培养瓶或培养皿在超净工作台中用紫外线照射消毒 30 分钟左右。从液氮罐或细胞库中取出 HNEpC 细胞,迅速放入 37℃水浴锅中解冻,解冻过程要轻柔摇晃,使其尽快解冻但避免细胞受损。解冻后的细胞悬液用培养基稀释后,以适当的细胞密度接种到培养容器中。例如,对于一个 25cm² 的培养瓶,初始接种细胞数量可为 5×10⁴ - 1×10⁵个。接种后,将培养瓶轻轻摇晃,使细胞均匀分布,然后放置在 37℃、5% CO₂的培养箱中培养。
培养条件维持细胞培养箱的温度应严格控制在 37℃,温度波动过大可能影响细胞的生长和代谢。CO₂浓度保持在 5%,CO₂主要用于调节培养基的 pH 值,使其维持在细胞生长适宜的范围内。定期检查培养箱的水盘,确保有足够的无菌水,以保持培养箱内的湿度。每天观察细胞的生长状态,可通过显微镜观察细胞的形态、密度等。HNEpC 细胞在正常生长情况下,应呈现出上皮细胞特有的形态,如多边形等,细胞之间连接紧密。当细胞密度达到 80% - 90% 左右时,需进行传代培养。
细胞传代当细胞需要传代时,先将培养瓶从培养箱中取出,在超净工作台中倒掉培养基,用无菌的 PBS 缓冲液轻轻清洗细胞 2 - 3 次,以去除残留的培养基和细胞代谢产物。然后加入适量的胰蛋白酶(一般 0.25% 胰蛋白酶为宜),使其覆盖细胞表面,放入 37℃培养箱中消化 1 - 3 分钟,具体消化时间根据细胞的状态和实验经验确定。当在显微镜下观察到细胞开始变圆并从培养瓶壁上脱落时,立即加入含有血清的培养基终止消化。轻轻吹打细胞悬液,使细胞分散均匀,按照合适的比例(如 1:2 或 1:3)进行传代接种到新的培养容器中,继续培养。
三、注意事项无菌操作整个细胞培养过程必须严格遵守无菌操作原则。在超净工作台中进行操作时,应提前开启风机和紫外线灯进行消毒。操作人员需穿戴无菌工作服、手套和口罩,使用的器械和试剂等均需经过严格的灭菌处理。任何污染都可能导致细胞培养失败,因此要格外小心。
细胞冻存为了保证细胞的长期保存和后续使用,需进行细胞冻存。当细胞生长状态良好时,可将细胞消化后制成细胞悬液,加入适量的冻存液(一般包含血清和 DMSO 等),调整细胞密度至合适范围(如 1×10⁶ - 5×10⁶个 /ml)。将细胞悬液分装到冻存管中,标记好细胞名称、冻存日期等信息,然后按照一定的降温程序(如先在 4℃放置 30 分钟,再转移至 - 20℃放置 1 - 2 小时,最后放入 - 80℃冰箱过夜,次日可转移至液氮罐中长期保存)进行冻存。
定期检测定期对培养的 HNEpC 细胞进行检测,包括细胞形态观察、细胞活力检测、微生物污染检测等。如发现细胞形态异常、生长缓慢或出现污染迹象,应及时采取措施,如丢弃污染的细胞、排查污染原因等,以保证细胞培养的质量和实验结果的可靠性。
通过以上规范的操作和注意事项,能够有效地培养 HNEpC 细胞,为相关的研究和实验提供良好的细胞模型。