自然杀伤细胞（NK细胞）是机体重要的免疫细胞，以其独特的特性和功能，逐渐在肿瘤、免疫性疾病等多个疾病的治疗中展露头角，成为一种新型有效的治疗方法。
NK细胞来源广泛，可以从外周血、脐带血、NK-92细胞系、多能干细胞（iPSC和ESC）诱导分化等多种来源获得。不过，无论是哪种来源，体外培养NK细胞都面临着扩增困难、细胞易失活或凋亡等问题。
针对这些问题，本文将以新鲜分离的PBMC为例，深入剖析如何高效扩增并保持NK细胞的高纯度。
实验材料
PBMC [单个核细胞(1-2×107活细胞)] 、NK扩增试剂盒、NK基础培养基、注射用重组人白介素-2（IL-2）、自体血浆/人血小板裂解液（PLT）、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶、细胞培养袋、离心管、Z型架、止血钳
✔适用多种来源NK细胞的培养
✔NK扩增效率高(可达10000倍)
✔NK细胞纯度高
实验准备
1.提前配制NK完全培养基：
Day1-6 NK完全培养基：NK基础培养基+ IL-2（终浓度 200IU/mL）+5%自体血浆；
Day6之后 NK完全培养基：NK基础培养基+ IL-2（终浓度 200IU/mL）+1%自体血浆；
注：若无自体血浆可使用PLT替代
2.将NK完全培养基预热至室温。
实验步骤
第0天
接种培养-第一次激活
1.复苏NK扩增试剂 A ；
1.1 NK扩增试剂A置于37℃水浴锅解冻后转移至生物安全柜内；
1.2将细胞悬液转移至无菌离心管中。逐滴缓慢加入10mL复温的NK基础培养基，边加边摇匀。离心（300×g ，5 min）；
1.3 弃上清，弹散离心管底部沉淀的细胞。随后加入适量配置好的NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+5%自体血浆/PLT）重悬细胞。
2.根据计数结果，取适量PBMC [单个核细胞(1-2×107活细胞)] 至50mL离心管中，加入复苏后的NK扩增试剂 A 细胞悬液；
3.随后转移至T75细胞培养瓶中混合均匀，标记(日期、细胞信息)，培养箱中静置培养(37℃、5%CO2)。
第3-6天
每天补液
根据细胞悬液颜色或细胞密度添加NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+5%自体血浆/PLT）。一般补液后细胞密度在1-1.5×106cells /mL。
Attentions:
1.当补液后总体积大于50mL时，转入T175细胞培养瓶中继续培养。
2.当补液后总体积大于200mL时，转入细胞培养袋中继续培养。
第7天
接种培养-第二次激活
1.培养时间考虑：
一般是培养第7天进行二次激活；
2.细胞量考虑：
Day7取样计数，细胞数量超过1×108准备进行二次激活，若低于1×108可以多培养一天再二次激活。
1.复苏 NK 扩增试剂 B；
1.1 、1.2 同复苏NK扩增试剂A的操作步骤；
1.3 弃上清，弹散离心管底部沉淀的细胞。加入适量配置好的NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+1%自体血浆/PLT）重悬细胞。
2.取样计数，将复苏后的NK扩增试剂B细胞悬液加入T175细胞培养瓶中混合均匀；
3.根据计数结果，计算并加入对应体积的NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+1%自体血浆/PLT）。
4.标记(日期、细胞信息)，培养箱中静置培养(37℃、5%CO2)。
第8-13天
每天补液
1.当细胞悬液体积大于200mL时，需进行转袋；
1.1 取注射器空筒放入Z型补液架中，旋下细胞培养袋上的螺纹帽与注射口连接，打开进出管卡扣，将细胞悬液转入细胞培养袋中；
1.2 根据计数结果，加入适量NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+1%自体血浆/PLT）；
1.3 进出管余液滞空后，卡扣卡紧取下进出管。旋紧细胞培养袋的螺纹帽并用封口膜密封，摇晃均匀。
1.4 标记(日期、细胞信息)，培养箱中静置培养(37℃、5%CO2)。
2.根据细胞悬液颜色或细胞密度补入适量NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+1%自体血浆/PLT）。一般补液后细胞密度1-1.5×106cells /mL，最终体积在1.8L。
第 14 天
细胞收集
一般培养14-16天左右，
培养体积可以达到2-8L，
细胞量大致在60-300亿，
此时可以离心收集细胞。
1.收集前轻晃培养袋，沉底的细胞悬浮起来后，将细胞悬液转移到离心瓶中，离心（400×g，10min）；
2.弃上清，使用适量的生理盐水/DPBS重悬细胞沉淀，可多瓶合并为2瓶，离心（400×g，10min）；
3.弃上清，使用适量的生理盐水/DPBS重悬细胞沉淀，取样并稀释5-10倍后计数；
4.根据计数结果，取全部或者部分体积进行离心（400×g，5min）；
5.使用适量的生理盐水重悬并转移到制剂袋中，4℃保存备用，或者使用免疫细胞高效冻存液（首宁生物，货号：SN-06-1410）进行冻存。
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NK扩增培养的注意事项
1
外周血、脐带血-起始细胞量
1.外周血，起始细胞量建议为1×107（PBMC，活细胞），起始体积是10mL；脐带血，起始细胞量建议为2x107（CBMC，活细胞），起始体积是20mL；
如果是冻存细胞，可以提前复苏培养24小时后计数，取对应量的活细胞开启NK扩增；
2
NK扩增试剂A和B的复苏操作顺序
NK试剂盒中的A和B，在37°C水浴解冻后，使用移液枪将A / B转移至离心管中，再滴加一定量的NK完全培养基（顺序一定不能反），离心去上清，与单个核细胞混匀后开启激活；
3
二次激活节点
Day7取样计数分析，细胞量在1-5×108范围内，可二次激活；
4
补液后细胞密度
Day3之后，每天都需要补充NK完全培养基，控制补液后细胞密度在1-1.5×106 cells/mL左右（该补液方案，可维持细胞高速生长）；
5
用于补液的 NK完全培养基 温度
每次补液的NK完全培养基需预热至室温，方可补液添加。
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