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从胚胎发育到疾病进展的生物过程中所涉及的细胞行为是由细胞与其微环境中复杂的生化和生物物理信号之间错综复杂的相互作用所调节的。尽管细胞因子和与细胞外基质（ECM）结合的生长因子等化学信号长期以来一直被认为是指导正常生理和病理过程的关键因素，但越来越多的人认识到基质力学也会对这些过程产生重大影响。其中，基质硬度已被广泛认为是细胞粘附、迁移、增殖和干细胞命运的主要调节因子。除了不同组织类型的机械硬度范围存在基本差异外，空间基质组织的异质性也会导致局部组织水平的变化，通常以梯度的形式出现。例如，受伤后组织变硬会产生远离伤口部位的硬度梯度，从而促进成纤维细胞的招募，帮助伤口愈合，而乳腺肿瘤发生过程中 ECM 硬度的增加与侵袭性癌细胞侵袭倾向的增加有关。细胞外基质提供了空间变化的物理线索，可在许多过程中影响细胞行为。水凝胶中模拟异质机械微环境的物理梯度有助于研究这些线索对细胞反应的影响。因此，非常需要简单可靠的技术来制造这种梯度水凝胶。

来自英国伯明翰大学的Daniele Vigolo 团队开发了通过在含有水凝胶前体溶液的微通道上施加温度梯度来制造刚度梯度结冷胶（GG）水凝胶。前体溶液中成分的热泳迁移会产生浓度梯度，这种浓度梯度反映了温度梯度曲线，在交联后会转化为机械梯度。利用这种技术，可在 600 微米的范围内生成刚度梯度从 20 到 90 千帕的 GG 水凝胶，涵盖了中等硬度到硬度组织的典型弹性模量。然后在这些梯度基底上培养 MC3T3 成骨细胞，这些细胞会向梯度上最硬的区域优先迁移并增强成骨潜能。总之，热透射法提供了一种无毒、有效的方法，可在微米尺度上制造具有确定机械梯度的水凝胶，适用于体外生物研究和潜在的组织工程应用。相关工作以题为“Fabrication of gradient hydrogels using a thermophoretic approach in microfluidics”的文章发表在2024年03月04日的国际知名期刊《Biofabrication》。

【制造硬度梯度水凝胶】

最近，一种利用热泳物理现象制造刚度梯度水凝胶的新型微流控技术被开发出来。利用这种技术，通过在含有水凝胶前体溶液的微流体通道上仔细施加和控制温度梯度，可以实现对水凝胶特性的局部操控（图 1(a)，上图）。为使热泳过程可视化，本研究在微流体通道中填充了 500 纳米的绿色荧光珠（以 1%的水溶液配制）。然后，通道的一侧被加热，而通道的另一侧则被冷却，所采用的系统设计与随后用于制造梯度水凝胶的设计相同，如下所述。图 1(a)（底部）显示，荧光珠在 45 分钟内沿着热泳力的方向向微通道的冷侧聚集。这一结果证实了热泳确实可以用来诱导微米尺度封闭内的粒子运动，本研究预计生物聚合物分子也会有类似的行为。

图1 在微流体中制造 GG 硬度梯度水凝胶

【机械和结构表征】

本研究利用原子力显微镜（AFM）在液体中进行力压痕测量，从而测定了所制备的 GG 梯度水凝胶宽度范围内的局部杨氏模量。对于以 1% w/v 初始 GG 浓度和 7.5 ℃ mm-1 应用温度梯度制备的水凝胶，本研究观察到在 600 µm 的距离上存在 20-80 kPa 的刚度梯度（图 2(b)）。本研究还对使用不同浓度 GG 制备的均匀刚度 GG 水凝胶进行了表征，并验证了基底刚度随浓度线性增加（图 1(c) 插图）。然后，浓度-刚度数据可用作校准主曲线，根据杨氏模量测量结果估算出整个制备的刚度梯度 GG 水凝胶的浓度曲线。这些结果支持了这样一种观点，即在微流体中应用热泳可以有效地在初始均化溶液中产生溶质浓度梯度，而且微通道内的对流效应并不明显。此外，通过保持挤出后水凝胶的取向，本研究确认最硬的区域位于最靠近冷通道的样品边缘。这表明，GG 溶液的索雷特系数为正，GG 线圈受到驱动力，向设备的低温区域移动。

本研究进一步证明了这种技术能够产生不同范围和梯度强度的硬度梯度。初始 GG 浓度的增加会导致整体水凝胶刚度的增加（图 2(c)），而通过增加微流体系统的温差可以实现更陡峭的梯度（图 2(d)）。原则上，利用这种热泳机制产生的浓度梯度呈现指数曲线，这也反映在所产生的硬度梯度中。随着温度梯度强度的增加，这种指数曲线会变得更加明显。相反，这意味着通过保持冷侧和热侧通道之间较小的温差，实际上仍然可以用较温和的外加温度梯度（例如 <3.5 ℃ mm-1 ）来制造线性刚度梯度水凝胶。由于由此产生的浓度梯度仅采用微妙的指数曲线，因此浓度（以及硬度）在基底的整个宽度上似乎呈线性变化，从而产生线性硬度梯度凝胶。

图2 梯度 GG 水凝胶的表征

【评估整个微流控系统的温度曲线】

对整个微流控系统的温度曲线进行表征至关重要，这样才能与相应的浓度梯度相关联，从而与最终水凝胶基底的硬度梯度相关联。实验中，本研究通过电阻模拟模型估算主通道上的实际温度梯度。使用本研究描述的系统，需要注意的是主样品通道上的温度将始终呈线性变化。为了验证这一点，本研究通过对虚拟微流体模型（图 3(a)）进行计算模拟，评估了整个系统的温度分布。本研究证实，整个微流体主通道的温度从热侧到冷侧呈线性下降，温度梯度的强度（图 3(b)）与实验得出的刚度梯度（图 2(d)）成正比。此外，本研究还探究了“冷”通道中不同水流速度对沿通道长度轴线产生的温度梯度均匀性的影响（图 3(c)）。在所有情况下，焦耳加热器的温度都被假定为恒定。对 300 µl min-1 的实验流速进行模拟后发现，进水口附近的温度梯度最高，沿设备长度方向逐渐下降，形成一个平台（图 3(c)）。这可能是由于水在流经通道时逐渐加热的缘故，但由于在随后的细胞培养研究中只使用了一小部分（1-2 厘米）已制备好的 GG 水凝胶，因此本研究能够获得合理均匀的刚度梯度基底，这一点已通过原子力显微镜测量得到验证。虽然本研究承认梯度水凝胶平台需要更高的生产水平才能使其在细胞培养应用中发挥作用，但在这项概念验证研究中，重点展示了热泳技术在基于细胞的研究中制造 GG 梯度水凝胶的适用性。重要的是，研究结果清楚地表明，只需调整微流体系统内的温度分布，就能控制硬度梯度曲线。在未来的发展中，有可能利用沿微通道固有的温度梯度变化，在同一装置中同时制造出多种具有不同硬度梯度强度的水凝胶。

图3 温度曲线的计算模拟

【较硬区域可促进细胞迁移和成骨矿化】

已有大量文献报道，干细胞系的分化和祖细胞的成熟可通过体外使用模拟相关原生组织弹性的工程基质来引导。因此，本研究推测，在跨越骨组织范围（>30 kPa）的GG梯度水凝胶上培养的成骨细胞，将以机械剂量依赖的方式（图4(a)）向基质的较硬区域显示出更强的成骨活性，这首次证明了这一平台在探究硬度依赖行为方面的实用性。本研究首先通过钙黄绿素-AM 和碘化丙啶阳性细胞的相对体积来测量细胞活力，这两种细胞分别表示活细胞和死细胞。7 天后的观察结果显示，未包覆的 GG 水凝胶上的细胞存活率高达 85%（图 4(c)），这证实了纯 GG 水凝胶的无毒制造工艺以及细胞培养的生物相容性。本研究还在第 1 天、第 3 天和第 7 天进行了二维共焦成像，以研究细胞对硬度梯度的扩散和迁移反应（图 4(b)）。本研究将细胞扩散计算为细胞面积，并通过计算 7 天内细胞密度在基底表面的分布来进一步评估细胞迁移。结果显示，细胞向基底较硬区域的扩散（图 4(d)）和迁移（图 4(e)）更多。此外，与对照样品（∼50 kPa）相比，梯度基底较软区域（20-30 kPa）的细胞面积和细胞密度较低。

图4 MC3T3 细胞在硬度梯度 GG 水凝胶上的行为

本研究进一步探究了硬度对基质矿化程度的影响，矿化是 MC3T3 细胞分化为成熟成骨细胞表型的指标。为了研究矿化程度，本研究用 X 射线荧光法（XRF）量化了培养 15 天或 30 天后 GG 基质上的钙磷（磷酸盐）沉积量（图 5(a)）。钙和磷含量的分布始终呈现出一种梯度模式，即从 GG 水凝胶的软侧向硬侧递增，这意味着较硬的基底会促进前成骨细胞的成熟（图 5(b)）。值得注意的是，尽管对照样本的硬度在梯度基底较硬区域（40-70 千帕）的范围内，但总体而言，与梯度凝胶相比，细胞在均匀凝胶上的矿物质沉积量较低。其中一个可能的解释是，僵化诱导了细胞沿僵化梯度的迁移和增殖。此外，为了探究化学和机械因素之间的相互作用，本研究比较了在正常培养基和成骨培养基中培养的细胞的矿化活性。后者导致均匀和梯度硬度 GG 水凝胶上的钙和磷沉积增加，而且矿物质沉积的分布同样取决于硬度。总之，本研究结果丰富了现有的文献，这些文献表明基质力学在控制成骨细胞功能和行为方面起着同等甚至更重要的作用。最重要的是，这也凸显出一种能在微米尺度上局部操纵基质力学的方法为创建具有预编程线索的支架提供了巨大的机会，从而实现体外复杂生理组织的工程化。本研究将范围限制在只产生线性梯度，但根据加热和冷却微流体网络的设计，可以实现更复杂的梯度形状。

图5 培养 30 天后的矿物质沉积

2. 总结与展望

水凝胶已成为一种无处不在的工具，可用于组织和呈现一系列模拟原生 ECM 的生物物理线索。近年来，这已被证明是一种特别有用的还原模型系统，可用于探测细胞与 ECM 的相互作用，并更好地了解孤立的机械线索如何驱动细胞行为。鉴于刚度梯度在生物组织中无处不在，最近有人提出了一种新技术，即利用微流体中的热传导效应，通过控制未反应前体成分的再分布来制造刚度梯度水凝胶。本研究展示了如何应用该技术制造出 600 µm 宽的 GG 水凝胶条，其刚度范围和梯度强度均可调。使用这些弹性模量范围在 20 ∼ 100 kPa 的生理相关水凝胶，本研究观察到在基底上培养的成骨细胞前体细胞表现出向梯度上较硬区域的定向迁移和矿化倾向。此外，与普通培养基相比，在补充成骨培养基中培养细胞时，矿化活性进一步增强，这凸显了生化和生物物理因素在协调细胞行为和功能方面的协同作用。与最常用的梯度光罩法和其他基于在水凝胶交联过程中控制光照射的策略相比，所提出的热泳方法可应用于各种类型的水凝胶，无论其交联机制如何，因此并不局限于单纯的光交联生物材料。本研究展示了相对陡峭的刚度梯度的生成，但也可以通过调整应用温度梯度和初始水凝胶浓度分别获得较浅的梯度和/或整体较软的基底。这一特性将使刚度梯度的制作能够覆盖生理（∼1 Pa µm-1 ）和病理（>10 Pa µm-1 ）条件下的全部力学范围，而这一直是大多数现有刚度梯度系统难以解决的技术难题。这种热致伸缩技术的另一个重要特点是，微流体通道配置可以定制，以创建更复杂的梯度模式，同时保持平滑的梯度轮廓，达到微米级分辨率。总之，本研究认为这种通用的多功能技术可以大大提高梯度水凝胶系统在体外生物研究中的相关性，并对生物材料和机械生物学等广泛领域产生深远影响。例如，热致伸缩技术可以成为利用空间定义的微尺度线索对水凝胶进行编程的重要工具，这种微尺度线索可以有力地引导体外工程组织的短期细胞活动，用于疾病建模和组织工程应用。

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