聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑
聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑，这里是聚焦前列腺癌的《菲长视野 · 前献解泌》专栏。
本期与我们用声音见面的是中山大学附属肿瘤医院李永红教授，他将与大家一同分享一项近日发表于《Cell》杂志（影响因子：64.5）的有关独立于谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）且受性激素差异调节的铁死亡监测机制研究。
铁死亡是一种由铁依赖性磷脂（phospholipid，PL）过氧化作用驱动的细胞死亡过程，在癌症、缺血性器官损伤等多种疾病中发挥重要作用。目前主要有两种监测机制可抑制铁死亡：一种由GPX4介导，该酶可催化磷脂过氧化物的还原；另一种由铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）等酶所介导，这些酶可产生具有自由基捕获抗氧化剂（radical-trapping antioxidant，RTA）活性的代谢物。越来越多的证据表明，铁死亡是介导多种肿瘤抑制剂抗癌活性的一种固有肿瘤抑制机制，诱导铁死亡可作为一种潜在的癌症治疗方法，以选择性消除具有特定遗传背景的癌细胞。因此，确定是否存在独立于GPX4和RTA的其它铁死亡监测机制，对开发诱导癌细胞铁死亡的新型联合治疗策略具有重要的指导意义[1]。
研究方法利用全基因组规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）激活筛选及进一步的机制研究，确定与铁死亡相关的监测的机制。
研究结果● 膜结合O-酰基转移酶结构域2（membrane bound O-acyltransferase domain containing 2，MBOAT2）是独立于Gpx4和FSP1的铁死亡抑制因子
为确定铁死亡抑制基因，研究者使用GPX4抑制剂RSL3和胱氨酸饥饿作为铁死亡诱导剂（ferroptosis inducers，FIN），对人成纤维肉瘤HT1080细胞进行全基因组CRISPR激活筛选（图1A）。发现在RSL3和胱氨酸饥饿条件下存活的细胞中，7个基因的单链向导RNA（single guide RNA，sgRNA）富集最多（图1B、C），其中MBOAT2和磷脂酶A2组IIF（phospholipase A2 group IIF Gene，PLA2G2F）是2种脂质修饰酶，既往未被报道可调控铁死亡。
为验证MBOAT2和PLA2G2F是否具有抑制铁死亡的功能，研究者在HT1080细胞中将二者进行过表达，发现它们均可抑制咪唑酮伊拉斯汀（Imidazole Ketone Erastin，IKE）和胱氨酸饥饿诱导的铁死亡（图1E、F），这两种诱导剂均通过耗尽GPX4辅因子谷胱甘肽（glutathione，GSH）诱发铁死亡。此外，还发现MBOAT2和PLA2G2F过表达可抑制RSL3诱导的铁死亡，RSL3是GPX4的直接抑制剂（图1G）。此后，研究者建立了HT1080-GPX4KO细胞作为自发性铁死亡模型（图1H）。值得注意的是，MBOAT2而非PLA2G2F过表达能使HT1080-GPX4KO细胞在没有trolox（一种水溶性维生素E）的情况下维持长期培养，与独立于GPX4的RTA生成酶FSP1、GCH1和NOS2的抗铁死亡功能类似（图1I）。研究者观察到FSP1在HT1080-GPX4KO细胞中上调，这可能是通过反馈调节的。因此，研究者建立了HT1080-Gpx4/FSP1DKO细胞（图1H），发现MBOAT2可有效挽救自发性铁死亡，并维持了Gpx4/FSP1DKO细胞的长期存活（图1J）。
综上所述，MBOAT2是一种有效的铁死亡抑制基因，其功能独立于GPX4和FSP1。
图1 MBOAT2是独立于Gpx4和FSP1的铁死亡抑制因子
● 在前列腺癌中，雄激素受体（Androgen receptor，AR）信号通路通过MBOAT2调节铁死亡
通过对不同癌症组织及正常组织中的MBOAT2信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平进行交叉比较，研究者发现MBOAT2在前列腺癌中通常表达上调（图2A）。通过分析一组前列腺癌细胞系，研究者证实MBOAT2在AR+前列腺癌而非AR-前列腺癌细胞系中高度表达（图2B）。重要的是，AR+前列腺癌细胞系通常比AR-前列腺癌细胞系更能抵抗铁死亡（图2C）。
研究者对既往发表的染色质免疫沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）数据集进行分析表明，AR及其辅因子FOXA1与一个假定的内含子雄激素应答元件（androgen response element，ARE）结合，该元件与MBOAT2的转录起始位点（transcription start site，TSS）接近（图2D）。通过ChIP-qPCR分析，证实了AR与MBOAT2 ARE的结合，AR激动剂双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）可增强这种结合，但AR拮抗剂恩扎卢胺（enzalutamide，ENZ）抑制了这种结合（图2E）。此外，DHT刺激AR+前列腺癌细胞系中MBOAT2的表达（图2F），而ENZ降低了MBOAT2的基线表达（图2B），并消除了DHT诱导的MBOAT2上调（图2F）。总体而言，MBOAT2是前列腺癌细胞中AR的真正靶点。
图2 在前列腺癌中，AR信号通路通过MBOAT2调节铁死亡敏感性
● AR拮抗剂增强AR+前列腺癌对铁死亡的敏感性
为了验证AR拮抗作用是否可通过下调MBOAT2使肿瘤细胞对铁死亡诱导敏感，研究者比较了正常介质和去除了雄激素的介质中LNCaP细胞（代表去势敏感性前列腺癌）和LnAR细胞（代表去势抵抗性前列腺癌）的铁死亡敏感性。结果发现ENZ和Bavdegalutamide（ARV-110）均呈剂量依赖性地抑制内源性MBOAT2的表达（图3A、C），且可强力增加包括CRPC细胞株LnAR在内的多种AR+前列腺癌细胞系对RSL3诱导铁死亡的敏感性（图3A-3D）。与预期一致，ENZ同样增强了RSL3诱导的脂质过氧化（图3E）。
为了测试ENZ是否可通过抑制MBOAT2的表达来增敏铁死亡，研究者建立了表达异位MBOAT2的LnAR细胞系（异位MBOAT2的转录不受AR或ENZ的调节）（图3G）。确实，ENZ仅在作为对照组的LnAR细胞中增敏铁死亡，而在表达异位MBOAT2的LnAR细胞中不致敏（图3F）。此外，ENZ未进一步增敏LnAR-shMBOAT2细胞中的铁死亡（图3H和3I），证实ENZ通过下调内源性MBOAT2而增敏铁死亡。
此后，研究者在AR+前列腺癌细胞中检测了ENZ是否能够消除外源性单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）对铁死亡的抑制作用，以及促进外源性多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）在增强铁死亡中的作用。事实上，尽管外源性油酸（oleic acid，OA）以剂量依赖性方式抑制未经治疗的LnAR细胞中RSL3诱导的铁死亡，但ENZ消除了OA的保护功能（图3J）。相反，在存在外源性亚油酸（linoleic acid，LA）的情况下，ENZ显著增强了铁死亡（图3K–3M）。
此外，研究者建立了LnAR-iCas9-gGPX4（LnAR-igGPX4）异种移植动物模型，证实可有效诱导GPX4基因敲除的多西环素（doxycycline，Dox）与ENZ的联合使用可完全抑制肿瘤生长，并引起明显的肿瘤消退（图3N-3P）。作为肿瘤铁死亡的标志物，PTGS2表达在联合用药组中显著上调（图3Q）。
图3 AR拮抗剂增强AR+前列腺癌对铁死亡的敏感性
● MBOAT1是另一种MUFA偏好的抑制铁死亡的溶血磷脂酰基转移酶（lyso-PL acyltransferase，LPAT），受雌激素受体（estrogen receptor，ER）调节
通过在HT1080细胞中过表达不同的酶，研究者进一步发现除了MBOAT2，MBOAT1同样可将细胞从GPX4基因敲除或RSL3引起的铁死亡中解救出来。此外，MBOAT1能够在不补充Trolox的情况下支持GPX4KO细胞的长期培养。因此，MBOAT1是另一种独立于GPX4，可抑制铁死亡的LPLAT。
有趣的是，与MBOAT2相反，分析表明MBOAT1在女性癌症中高度表达，包括卵巢癌、乳腺癌和子宫内膜癌等，研究者通过进一步实验证实MBOAT1受ER信号的调控。总体而言，MBOAT1是ER的直接转录靶点。
需要强调的是，AR调节MBOAT2但不调节MBOAT1，而ER专门调节MBOAT1但不调节MBOAT2。这些结果表明，MBOAT1和MBOAT2分别在ER+和AR+肿瘤中受到不同的调节，从而抑制铁死亡。
研究结论MBOAT1和MBOAT2是性激素依赖性铁死亡调控因子，分别对ER+乳腺癌和AR+前列腺癌具有重要治疗意义。
专家有话说自铁死亡的概念被提出以来，相关研究数量呈指数增长。越来越多的证据表明，铁死亡是介导多种肿瘤抑制剂抗癌活性的一种固有肿瘤抑制机制，如何通过调控细胞铁死亡来干预相关疾病的发生发展已成为肿瘤病因学研究和治疗的热点和焦点。这项研究发现，在前列腺癌中，AR信号通路通过MBOAT2调节铁死亡，AR拮抗剂可以通过下调MBOAT2增强前列腺癌对铁死亡的敏感性，为前列腺癌治疗提供了新的解题思路。
随着医学技术的不断发展，如针对BRCA突变的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂，包括Ra-223、Lu-177、Ac-225在内的核素治疗等新型疗法如雨后春笋般层出不穷，为前列腺癌带来了更多的治疗选择。但许多药物仍处于研究阶段，可及性存在一定问题，雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy，ADT）仍是前列腺癌治疗的基石。
曲普瑞林作为代表性的ADT药物之一，在前列腺癌领域深耕多年，2023年其6月长效剂型也在中国获批，进一步丰富了ADT药物的剂型选择。曲普瑞林6月剂型可长期保持血药浓度稳定，更有利于前列腺癌患者的长程管理。一项开放标签、非比较研究[2]，纳入120例晚期前列腺癌患者，按照6个月用药间隔给予患者两次曲普瑞林6月剂型治疗，对其中的15例患者进行曲普瑞林血清浓度监测。结果显示，曲普瑞林6月剂型治疗血药浓度可长期稳定维持至24周，保持疗效稳定[2]。
同时，曲普瑞林6月剂型可以进一步减少注射次数，提高治疗便利性，更受医生及患者青睐。法国的一项前瞻性观察研究[3]，分析了1438例前列腺癌初治患者在治疗第3、第6和第12个月时的医生处方及患者偏好。结果显示，84.6%的患者从初始使用3月剂型更换为6月剂型，医生选择处方6月剂型最常见原因是“治疗方案简化”（86.9%）和“减少不必要的就诊”（46.8%）[3]。曲普瑞林6月剂型的获批为我国前列腺癌诊疗注入了新活力，期待曲普瑞林6月剂型可以为我国前列腺癌患者带来更多获益，也期待我国抗肿瘤事业再攀高峰！
专家简介
李永红 教授
中山大学附属肿瘤医院
中山大学附属肿瘤医院泌尿外科副主任、 前列腺肿瘤病区主任
主任医师 、硕士生导师
前列腺癌单病种专家
广东省杰出青年医学人才、羊城好医生
中国临床肿瘤学会（CSCO）前列腺癌专家委员会委员
中国抗癌协会男生殖系肿瘤专业委员会委员
中华医学会泌尿外科学分会男科学组委员
中国医师协会肿瘤消融治疗技术专家组泌尿系肿瘤消融专业组组长
广东省抗癌协会泌尿生殖系肿瘤专业委员会副主任委员
广东省医学会机器人外科学分会常委、秘书
擅长前列腺癌的诊断和治疗。作为第一/通讯作者在 “European Urology”、“Clinical Cancer Research “、”Prostate”、“Prostate Cancer and Prostatic disease”、”Urology” 等杂志发表论文20余篇，研究成果被美国NCCN指南、中国CSCO指南及《Campbell Urology》引用
主持国自然科学基金面上项目等多项研究基金
参考文献
1. Liang D, et al. Cell. 2023 Jun 22;186(13):2748-2764.e22.
2. Lundström EA, et al. Clin Drug lnvestig.2009;29(12):757-65.
Lebret T, et al. Ther Adv Urol. 2014 Dec;6(6):205-14.
编辑：Nobody
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