细胞毒性检测：利用细胞培养技术，采用细胞毒性试验评价一种器材、材料或药物引起的细胞死亡、细胞生长抑制或者细胞方面其他的影响。

CCK-8（Cell Counting Kit-8）检测法，是一种常用的测定细胞增殖或者细胞毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。CCK-8检测法具有灵敏度高、重现性好、可直接加入细胞样品中，不需要与其他组分预混以及洗涤细胞、操作简单便捷、无需有机溶剂、对细胞毒性小、检测准确等优点。基于以上的优点，CCK-8检测法应用较为广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏实验以及一些生物因子的活性检测等。

接下来，就让我们看一下具体的实验步骤和注意事项吧！

实验步骤

1、实验设计，根据实验需求，设计实验孔板布局和药物处理时间，建议预先规划好加药时间和检测时间。

2、细胞铺设96孔板，以HEPG2细胞为例，约1E4/每孔。细胞数目应根据细胞种类、大小调整。

3、贴壁后，吸除上清，加入100μL培养基稀释的相应浓度药物。

4、根据实验需求，安排药物处理时间。

5、可每孔直接加入10μL CCK-8。

6、或预先配制好CCK8稀释液：1mL CCK-8原液+9ml培养基（96孔板每个孔加入100μl）。将96孔板中药物培养上清液用排枪吸出保存到新的96孔板中，做好标记，于20℃冷冻保存，用于下一步测定上清中细胞因子，吸出后再加入100μL CCK8稀释液，注意取三个空白孔加入100μL CCK-8，用于后续减去试剂本底。

7、CCK8稀释液加完，将孔板放于培养箱孵育0.5-4h。

8、酶标仪中于450nm波长处测定吸光度。

注意事项

01

第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

02

接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀，导致每孔中的细胞数量不一致。

03

培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。

04

若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。

05

加培养基和CCK-8时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰OD值。

06

检测吸光度时需保证检测孔中无气泡。若存在少量气泡，可用针头蘸酒精戳破，再于450nm测定吸光度。

07

CCK-8 对细胞的毒性非常低，部分其他细胞实验，例如中性红法或结晶紫法，可在 CCK-8 法检测完后继续进行。

08

若处理细胞的药物为小分子药物，无吸光性，可直接于450nm测定吸光度。若药物为纳米颗粒等，有色有吸收，可以将孔板于1000rpm，离心3-5min后取80μl上清于新的空白96孔板中，使用酶标仪测定450nm的吸收。