相信很多小伙伴初入细胞实验室时，都会被师姐叮嘱：“细胞冻存和复苏，一定要记住慢冻速融”。

1.什么是细胞冻存和复苏？

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的重要作用。

细胞复苏是指将冻存在液氮里边或者-80℃冰箱中的细胞解冻，再培养传代。

2.为什么要慢冻？

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂

3.为什么要“速融”？

细胞复苏应采用快速融化的方法，这样的目的是为了让细胞外结晶在很短的时间内融化，从而避免慢悠悠的融化，使得小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶，从而对细胞再次造成伤害，从而影响细胞的存活率。

也就是意味着从液氮中取出来的冻存管，要立即浸入37℃温水中，尽量在1~2min内融化。

那么除了慢冻速融，细胞复苏过程中还有其他需要注意事项吗？

当然有！

4.细胞解冻后处理

许多实验室都是将解冻后的细胞直接接种于含有完全培养基的细胞培养瓶或者培养皿中直接培养，过夜后再进行换液，换液的目的是将冻存液中的DMSO去除掉。

但是如果我们所培养的细胞对冷冻保护剂很敏感的话，解冻后的细胞应先加入预先准备的含培养基的离心管，再通过离心去除保护剂，再接种到含完全培养基的培养瓶或者培养皿中。这里所提到的离心，一是为了去除DMSO，一是为了去除死细胞碎片。

PS：富衡实验室为了保证细胞质量，都是直接离心去除冻存液的哦。

5.细胞悬液离心

细胞悬液离心后，要注意细胞沉淀，有时冻存细胞较少，或某些细胞不易沉淀在离心管底部，可能吸附在管壁。

6.冻存管的炸裂问题

这个是特别需要注意的，以前师姐提醒的时候还没怎么注意，直到它在我手里炸了两次之后，长记性了。

冻存管容易爆炸的原因主要是因为冻存管质量差，或者盖子没拧紧，导致冻存过程中液氮渗入到冻存管中，取出后，液氮容易挥发，导致体积迅速膨胀，但是又不能及时的排出引起爆炸。

针对于这个问题可以从以下几个方面稍微避免一下：

1).取放置冻存管的冻存盒的时候要戴好防冻手套以及护目镜，准备好镊子；

2).推荐使用内旋的冻存管，毕竟内旋的冻存管，易于排出，不宜爆炸；

3).但是如果没有内旋的，只能用外旋的冻存管的话，取出后尽快倒置或是水平放置数十秒，使得液氮流出；

4).可以先放到-80℃的冰箱中，等液氮挥发干净后，再去复苏，或者是把管子放置于冰上，等到液氮挥发后，再进行复苏。

5).另外，也有小伙伴提到，冻存细胞时，可以贴上封口膜，避免液氮进入冻存管。

7.培养基的PH值

细胞复苏的过程中，很重要的一点就是避免培养基的过度碱性。建议可以提前将培养基放入培养箱15min，以便培养基达到正常的PH值。

8.确认复苏后细胞情况

至于复苏后是否成功，要根据接种后细胞的形态和贴壁率而定，倘若第二天有90%以上的细胞贴壁，且形态良好，则说明复苏成功。

9.复苏接种密度

复苏接种的时候，建议采用较高的接种密度，使细胞的整体密度高一些，有利于细胞的生长。