适配体的筛选原理

摘要：本文全面介绍了适配体，阐述了适配体的筛选原理，着重分析了其高亲和力、易于合成修饰、稳定性高和低成本等特性。详细探讨了适配体在生物传感器、临床诊断和药物开发以及细胞成像等领域的应用。同时，也对适配体在临床应用中面临的挑战进行了剖析，并对其未来发展前景进行了展望，旨在为适配体在生物医学领域的深入研究和广泛应用提供全面的参考。

在生物医学领域，寻找能够特异性识别和结合目标物质的分子一直是研究的重点。适配体作为一种新型的分子识别元件，近年来受到了广泛的关注。适配体，也称为核酸适配体，是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或短的多肽，能够与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。这种独特的性质使得适配体在生物传感器、临床诊断、药物开发等多个领域展现出巨大的应用潜力。本文将对适配体的筛选原理、特性、应用、挑战与前景进行详细的阐述。

SELEX 技术，即体外指数富集配体的系统进化的组合化学技术，是 20 世纪 90 年代初新兴并迅速发展起来的一项关键技术。在其诞生之前，科学家们在研究核酸结构与功能时面临诸多困难，难以高效地筛选出具有特定结合能力的核酸序列。SELEX 技术的出现，犹如一把钥匙，开启了核酸适配体研究的大门。它的发展并非一蹴而就，早期的实验设计和操作方法相对简单，经过众多科研人员的不断探索和改进，逐渐成为一种成熟且高效的筛选工具。

人工化学合成一个文库容量为 10^14 - 10^15 的随机寡核苷酸文库，这是筛选适配体的基础。文库的总长度一般为 70 - 100 nt，中间包含 20 - 40 nt 的随机序列，这些随机序列为筛选出特异性适配体提供了丰富的序列多样性。当文库与靶标物质孵育时，就像一场分子间的 “配对游戏”，寡核苷酸序列与靶标物质相互作用，尝试形成特异性结合。孵育一定时间后，核酸 - 靶标的复合物逐渐形成，此时利用一定的方法除去未与靶标结合的文库序列，这一步至关重要，它如同筛子，过滤掉无效的序列。随后，通过复合物热解离获得与靶标结合的序列，并以此为模板进行 PCR 扩增。PCR 扩增就像是 “复印机”，大量复制这些特异性结合的序列，进而制备下一级文库。如此经过 8 - 20 轮不断筛选，每一轮筛选都像是在分子的海洋中不断提纯，最终获得对靶标具有高特异性与高亲和力的寡核苷酸序列，即适配体。适配体经克隆测序后获得相应核酸序列，这些序列就成为后续研究的宝贵资源，为进一步探索适配体的功能和应用奠定了基础。

硝酸纤维素膜过滤法在蛋白质适配体筛选中有着独特的应用。例如，Joshi 等基于硝酸纤维素膜设计了一种横向流动色谱装置，将该装置与 SELEX 筛选技术巧妙结合。在实验过程中，他们经过 7 轮正筛和 3 轮反筛，就像在复杂的分子迷宫中精准导航，最终获得了针对鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白 (Omp) 的高亲和力适配体 33 和 45 序列，其检出限低至 10 - 40 cfu/mL，这一成果为沙门氏菌的检测提供了新的高效手段。

凝胶柱也是适配体筛选常见的固定介质。Tang 等基于琼脂糖凝胶树脂应用 SELEX 技术，在对红豆毒素适配体的筛选中，他们精心设计实验条件，经过多轮筛选，成功获得对红豆毒素具有高特异性与高亲和力的适配体，其解离常数低至几 nmoL 范围，这一发现对于研究红豆毒素的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。

近些年来，以微孔板为固定介质筛选适配体应用广泛。王立峰等基于微孔板技术，在对癌胚抗原 (CEA) 适配体的筛选中，通过优化实验参数，成功筛选获得能与 CEA 特异性结合的高亲和力适配体序列。后续研究表明该适配体在肿瘤早期诊断、监测与治疗方面具有重要作用，为肿瘤的精准医疗提供了新的思路和方法。

FluMag - SELEX 技术是结合应用磁珠与 SELEX 技术筛选荧光适配体的一种创新方法。该方法的优势在于需要靶标量少，并且可通过荧光直观测定结合适配体的量，就像给适配体筛选过程安装了一个 “可视化窗口”。Kim 等应用 FluMag - SELEX 技术筛选获得广谱抗炎性药物布洛芬的 5 条特异性适配体。其中三条是外消旋布洛芬的特异性适配体，另外两条能与外消旋和内消旋布洛芬特异性作用。这些布洛芬适配体特异性强，与布洛芬类似物、土霉素均没有结合作用，这一特性为布洛芬药物的检测和相关疾病的治疗提供了精准的分子工具。Xu 等应用 FluMag - SELEX 技术筛选获得多氯联苯的特异性适配体，其解离常数为微摩尔级别，且在 0.1 到 100 ng/mL 范围内线性良好，这对于环境中多氯联苯的检测和污染治理具有重要的应用价值。

不同组分间的荷质比存在一定差异，这一特性使得物质的电泳迁移率有所不同，从而实现不同组分的分离，CE - SELEX 技术正是基于这一原理。该技术能在 2 - 4 轮内实现高亲和力适配体的筛选，常被用于筛选蛋白质、脂多糖、多肽等大分子物质，大大提高了筛选效率。Yang 等首次利用 CE - SELEX 实现了对小分子物质甲基吗啉的适配体的筛选，经过 3 轮筛选后获得了 8 条高亲和力适配体，其解离常数为几百 nM 到几 uM，其中两条序列能够催化中卟啉的金属插入反应，催化强度分别为 1.7 倍和 2 倍，这一发现不仅拓展了适配体的应用领域，还为相关化学反应的研究提供了新的催化剂。针对亲和力较弱的适配体与靶标体系存在动态解离平衡这一问题，科研工作者发展了平衡混合物的非平衡毛细管电泳 (NECEEM)、平衡混合物的平衡毛细管电泳 (ECEEM) 和 Non - SELEX 毛细管电泳技术。Ashley 等应用 Non - SELEX 技术筛选获得过氧化氢酶的适配体，作者应用荧光分光广度计与毛细管亲和力电泳表征了其亲和力与特异性，结果显示适配体对靶标的亲和力比与其他四种蛋白的亲和力高至 100 倍，也显示了其高特异性。该适配体可应用于生物传感器、免疫印迹与生物标志物鉴定，为相关领域的研究提供了重要的工具。Ashley 等又基于 NECEEM 和 SELEX 技术筛选获得在自由的三维空间环境的人类瘦素蛋白的适配体，其解离常数为几百 nM，这对于研究人类瘦素蛋白的功能和相关疾病的发病机制具有重要意义。

Cell - SELEX 技术的主要靶标物质是细胞、细菌或病毒等。在操作过程中，采用离心、沉淀的方法分离去除未结合适配体，再通过热解离或酶切作用获得特异性适配体序列。Liang 等针对感染狂犬病毒的活细胞，应用 Cell - SELEX 经过 35 轮重复筛选获得了 5 条 DNA 适配体。病毒效价测定与实时定量反转录 PCR 实验均表明筛选获得的 5 条适配体能够抑制狂犬病病毒的复制，为狂犬病感染的治疗提供了一种可能性，这为狂犬病的防治带来了新的希望。Ninomiya 等应用 Cell - SELEX 经过 11 轮重复筛选，获得 12 条与人类肝癌细胞 HepG2 特异性结合的高亲和力适配体，其解离常数范围为 19 - 450 nM。作者分析获得 12 条适配体共有的二级结构，这与 HepG2 识别密切相关。该方法可以在靶标性质不明确、结合位点未确定的情况下进行筛选，并且无需制备靶标的复杂过程，为研究未知靶标的适配体筛选提供了一种高效的方法。

相比较传统微生物培养，适配体检测具有诸多优势。传统微生物培养往往需要较长的时间，从样本采集到最终检测结果可能需要数天甚至数周，而适配体检测周期短，能够在较短的时间内给出检测结果，大大提高了检测效率。在检测限方面，适配体具有低检测限的特点，能够检测到极低浓度的目标物质，这是传统微生物培养难以企及的。适配体具有高亲和力与强特异性，这源于其具有较大表面积和大量受体结合位点，且空间三维构型易形成螺旋、发卡、茎环、凸环、三叶草和假结等结构，能够与靶标物质基于范德华力、氢键和疏水作用等紧密结合，并可以区分结构类似物质。例如，在检测某种致病菌时，适配体能够精准地识别目标菌，而不会受到其他类似菌的干扰，这对于快速准确诊断疾病具有重要意义。

与抗体检测相比，筛选获得的适配体易于体外大量合成。抗体的制备往往需要经过动物免疫等复杂过程，不仅耗时费力，而且产量有限，而适配体可以通过化学合成的方法在体外大量制备，重复性好。适配体的稳定性高，在不同的环境条件下，如不同的温度、pH 值等，仍能保持其结构和功能的稳定性，易于贮存。而抗体在一些条件下容易发生变性，影响其检测效果。

相比较分子生物学方法，适配体操作简便易行。分子生物学方法往往需要复杂的实验设备和专业的技术人员，操作过程繁琐，而适配体的检测方法相对简单，不需要复杂的仪器设备，降低了检测成本。适配体靶标广泛，包括农药、组织、细胞、病毒、蛋白质、毒素、维生素和过敏原等，几乎涵盖了生物医学和环境检测等多个领域的各种物质，这使得适配体在不同领域都具有广泛的应用前景。适配体易于标记荧光且活性不受影响，因此易于结合应用其他检测技术，如荧光成像技术、电化学检测技术等，进一步拓展了其应用范围。

荧光标记适配体或适配体复合物是适配体应用于细胞成像的基础。流式细胞仪、荧光分光光度计常被用于测定荧光标记适配体与靶细胞结合力的大小，它们就像精准的 “测量仪”，能够准确地量化这种结合程度。荧光显微镜则能够呈现复合物的直观图像，让研究人员直观地观察到适配体在细胞内的分布和作用情况。Wang 等基于 FISH 技术和荧光标记的特异性 DNA 适配体构建了绿脓假单胞菌的成像检测系统。在这个系统中，荧光标记的适配体就像一个 “荧光灯塔”，精准地定位绿脓假单胞菌，实现了对该菌的快速成像检测。荧光适配体探针还可以用于细胞内部的显微成像。Valencia 等基于核糖核酸结合蛋白质及其适配体间的相互作用，实现了大肠杆菌活细胞内细菌 RNA 的成像工作，这为研究细菌基因表达和调控机制提供了新的工具。

科研工作者已经研发了多种抗癌药物，纳米材料也广泛应用于药物的传送，但其具有生物相容性差、不能定向传送且对其他细胞伤害大的缺点。适配体能够与靶标特异性结合，纳米材料 - 特异性适配体复合物能够实现药物在细胞内的定向传递。Chang 等构建了一种五角星构型的纳米材料二十面体，其与特异性适配体 DNA 结合后可以携载阿霉素，就像一艘精准导航的 “分子飞船”，定向传送到病灶位置，特异性导致上皮癌细胞死亡。这种靶向药物传送系统的构建，为癌症的精准治疗提供了新的策略，有望提高癌症治疗的效果，降低药物的副作用。

研究发现 MCF7 附膜抗原蛋白的特异性适配体能够通过生物素 - 链霉亲和素反应与补体组分 1 (C1q) 结合，显著诱导癌细胞膜的渗透压膨胀甚至细胞死亡，对于乳癌的治疗具有一定作用。这一发现揭示了适配体在癌症治疗中的潜在机制，为乳腺癌的治疗提供了新的靶点和治疗思路。适配体的动力学性质与促凋零作用表明 GSH - RNA 适配体是一种潜在的抗癌化学治疗剂，其在癌症治疗领域的应用前景值得进一步探索和研究。

食源性致病菌的检测是科学工作者研究的重要课题，目前适配体已经广泛地应用于致病菌的检测。Joshi 等应用 SELEX 技术，筛选获得了鼠伤寒沙门氏菌的两条适配体，其检测下限可达 10 - 40 cfu/g，实现了环境与食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速灵敏检测。这对于食品安全检测具有重要意义，能够及时发现食品中的致病菌，保障公众的健康。

适配体作为一种新型的分子识别元件，凭借其独特的筛选原理、众多的优点以及广泛的应用领域，在生物医学和化学生物学等领域展现出了巨大的潜力。尽管在临床应用中还面临一些挑战，如体内特异性低、肾脏清除速度快以及大规模生产和质量控制等问题，但随着技术的不断发展和创新，如引入非天然核酸、开发高效的核酸扩增酶以及在复杂环境中筛选适配体等，这些挑战有望得到克服。未来，适配体在临床诊断、药物治疗、生物成像等领域将发挥更大的作用，为人类健康事业做出重要贡献。我们相信，在科研人员的共同努力下，适配体将在生物医学领域不断开拓创新，为疾病的诊断和治疗带来更多的突破和发展。