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在推进神经组织再生方面，生物材料支架已经成为一种很有前途的候选材料，为神经中断提供了潜在的解决方案。在这些支架中，具有精心设计的微米尺度通道的多通道水凝胶是指导轴突生长和促进细胞相互作用的重要工具。在此，葡萄牙阿威罗大学Paula A.A.P. Marques和Joana P.M. Sousa探讨了用甲基丙烯酰基结构域（AMMA）修饰的人羊膜在神经干细胞（NSC）培养中的创新应用。以多通道支架形式制备的AMMA水凝胶具有类似于生理环境的柔软性，模拟神经束的自然样微结构。AMMA水凝胶膜的初步实验显示了其在神经学方面的应用潜力，证明了在不需要额外涂层的情况下，NSCs粘附、增殖并分化。过渡到3D领域，多通道结构形成复杂的神经元网络，引导神经突起的纵向延伸。此外，细胞阵列中突触囊泡的存在表明功能性突触连接的建立，强调已发展的神经元网络的生理相关性。本研究有助于为再生神经科学寻找伦理、临床转化和功能相关的方法。

相关研究结果以“Amniotic Membrane-Derived Multichannel Hydrogels for Neural Tissue Repair”为题于2024年7月11日发表在《Advanced Healthcare Materials》。

图1 dAM染色体的蛋白质组学分析

质谱分析发现，在去细胞化羊膜（dAM）中共有574个蛋白质。图1显示类别中蛋白质丰度相对于总蛋白质数量的分布。在dAM基质组中发现一组包含整合素结合域的蛋白质（图1B、C）。

图2 AMMA多通道水凝胶的制备工艺及结构特征

为了制备多通道水凝胶，本研究开发了一个由3D打印底座组成的两件式模具，该3D打印底座有16根直径250μm，高2mm的管状聚二甲硅氧烷（PDMS）柱（图2A）。使用该定制模具生产的AMMA水凝胶包含其结构中预期的微通道（图2B）。多通道水凝胶的微观结构显示，表面形貌显示出交替的波峰和波谷，以及明显的通道（图2C、D）。在横截面上观察到，水凝胶的内部结构显示出平均直径为25 ± 8 μm的互联孔隙网络（图2F）。接下来研究了其溶胀、保水和降解特性。支架的膨胀率为负，在PBS中浸泡5 min后达到约−5%，之后趋于稳定（图2G）。在细胞培养条件下检测支架降解特性，在指定时间段内的减重情况如图2H所示。降解率随时间的推移而下降。为深入了解AM水凝胶的力学特性，进行机械压缩试验，其应力−应变曲线如图2I所示。水凝胶的最终应变达到41.8 ± 3.4%，最终应力为14.7 ± 3.6 kPa（图2J）。

图3 在AMMA水凝胶膜上培养的NSC活力和增殖能力

图4 AMMA水凝胶膜和多聚-L-赖氨酸（PLL）包膜上NSC的分化研究

图5 在AMMA水凝胶膜和PLL涂层包覆物上的突触形成

通过抗巢蛋白（脑肿瘤干细胞标志物）染色，在5天内观察到AMMA水凝胶膜上的细胞动力学（图3A）。图3B使用活/死试验对细胞毒性进行研究。使用Fiji Image J软件评估活细胞和死细胞覆盖的整体表面积（图3C）。代谢活性分析表明在整个培养期间，细胞仍保持存活并继续增殖（图3D）。

神经发生代表成熟神经元形态建立的关键阶段。这一过程涉及到神经元之间的功能连接的形成，是神经回路形成的一个关键标志。分化第10天，神经元和星形胶质细胞分别用TUJ-1和GFAP染色，并用共聚焦显微镜观察，与对照组相比，AMMA可显著促进NSC向神经元的分化（图4）。

为评估神经突分支是否与功能性神经元连接相对应，接下来研究了突触素的表达，这是一种已知的调节中枢神经元突触囊泡内吞动力学的蛋白。共聚焦显微镜分析显示，TUJ-1+细胞与突触素标记物共定位，表现出神经突起和体细胞的特征点状标记（图5）。

图6 用AMMA多通道水凝胶培养的NSC的活力和增殖能力

图7 在多通道水凝胶上接种7天的NSC荧光素（红色）和DAPI（蓝色）染色

图8 AMMA多通道水凝胶培养NSC的分化研究

图9 突触素蛋白表达的检测

在成功证明AMMA有效支持2D NSC培养的特性后，本研究检测了具有纵向通道的3D AMMA水凝胶，以评估NSC的体外生长。活死实验共聚焦显微镜图像显示，随着时间的推移，在水凝胶表面和通道内的细胞数量逐渐增加（图6A）。在水凝胶顶部的三个时间点上，细胞活力一直保持在很高的水平（图6B）。通道内的细胞活力从第1天的89%增加到第7天的95%（图6C）。对代谢活性的分析显示，在7天的培养期间，细胞持续增殖（图6D）。在第7天，细胞核和F-肌动蛋白丝的染色进一步证实这些结果（图7）。染色清楚显示整个支架表面细胞有效覆盖，证实成功粘附并增殖。图7C显示细胞在3D基质中的渗透和整合，突出支架允许细胞浸润的特性。

随后，本研究通过检测与神经元（TUJ-1）和星形胶质细胞（GFAP）表型相关的标记物，评估AMMA水凝胶促进NE-4C细胞分化的潜力（图8）。此外，用突触素标记神经元的突触囊泡，免疫染色显示，存在大量突触囊泡，显示与神经球和神经突延伸共定位（图9）。

全文小结

AMMA水凝胶完全起源于人类，在提高体外研究的精度方面具有巨大潜力。此外还提高了将实验室研究结果转化为临床实践的可能性，代表朝着弥合研究和临床应用之间的差距迈出的重大进展。本研究展示了AMMA在神经组织工程方面的潜力。在2D条件下，底物促进细胞粘附和增殖，同时促进神经元分化。向具有快速自定义多通道几何结构的3D结构的过渡不仅会导致神经元覆盖表面，而且还会在通道中导航，促进复杂3D神经元网络形成。多通道结构在神经系统损伤领域具有广泛的潜在应用。这些支架不仅有能力在其通道腔内运输细胞和药物，而且还提供对结构设计的高水平控制。优越的结构设计灵活性对于临床转化至关重要，可匹配不同的损伤解剖结构。总之，AMMA有潜力成为创新仿生支架的基础，允许在体外复制中枢神经系统和PNS组织结构，并为临床植入物的发展做出贡献。

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