1927年4月18日上午,国民政府在南京举行定都典礼。由于南京国民政府成立仓促,当时还未来得及刻制国玺,只镌刻了一方“中华民国国民政府”印,由监察委员蔡元培代表国民党授印,胡汉民代表国民政府受印。

1928年10月,蒋介石当选为中华民国国民政府主席兼陆海空军总司令。登上中国最高权力宝座的蒋介石,急需要一颗新的国玺来替换中华民国国民政府印。在他的授意下,11月2日,国民政府国务会议议决:制玉质国玺,文曰“中华民国之玺”。后来又规定了国玺的尺寸、形状。由于一时缺乏荆山之玉,只好留待日后制作。

蒋桂战争爆发后,陈济棠公开支持蒋介石,蒋介石遂委陈济棠为广东特派员,将两广大权交给了陈;令其“随即返粤,不必入京”。陈济棠受宠若惊,对蒋介石的知遇之恩感激涕零,但不知道该怎样回报蒋介石。于是他专门咨询古应芬。古应芬告诉陈济棠：蒋介石亟需一颗国玺，但没有合适的印材。

陈济棠立即派人去缅甸，终于寻到一块上好的青翠玉石，以9500元大洋的高价将其购回，并托国民政府文官长古应芬带到南京，献给蒋介石。蒋介石请玉石专家鉴定，果然是块稀世珍宝，决定以此制成国玺，遂将这块缅甸玉石交给印铸局局长周仲良，让其负责刻玺工程。

周仲良专门组织了一套人马，自己亲自督制，王褆负责监工并篆文。王褆是民国时期著名的书法家，西泠印社的创办者之一，凡钟鼎、籀书、隶书、楷书无所不精，尤通晓治印。民国初年，王褆曾在北京政府印铸局任技正，袁世凯的“中华民国之玺”六个篆字，就出自他的手笔。

此次，王褆使出浑身本领，书写了“中华民国之玺”几个字，与北京政府的玉玺篆字风格有异，更见功力。刻玺工程从1929年7月1日开始，到10月9日国庆前一日琢刻完竣，成为向双十节献的一份大礼。南京国民政府的这枚国玺，比北京民国政府的国玺略有扩大，为13厘米，更显厚实庄重，主要用于国内及外交事务文件的签署。

国玺是表示国家最高权力的信印。此外，还有一枚羊脂玉打造的“荣典之玺”应该算不上严格意义上的“国玺”，它是由新疆省政府1930年7月采献，1931年元旦蒋介石亲自受呈，并于同年7月1日启用，为国家元首颁发勋章褒奖令之用。1948年5月20日，蒋介石就职总统后，特由典玺官专司保存这两枚印玺。

1949年4月23日，李宗仁带着中华民国之玺逃离南京后，辗转去了广州，后去了重庆。蒋介石欲利用桂系的力量上台，请白崇禧说服李宗仁共推蒋介石重新出山，遭到李宗仁拒绝。但是后来那两枚印玺还是被蒋介石带到了台湾。