文|面包夹知识
编辑|面包夹知识
«——【·前言·】——»
花鲈是广温广盐的肉食性鱼类，具有肉质鲜美、营养丰富等特性，在我国广泛养殖，其在2022年，产量高达218053t，对比2021年上涨9．53%。
关于棉籽油和大豆油，在水产生物应用上比较的研究，目前鲜见报道，棉籽油是否可以完全替代花鲈饲料中的大豆油有待进一步探究。
因此，本研究分别以大豆油和棉籽油为主要油源，探究其对花鲈生长性能、形体指标、血浆生化指标、脂质代谢能力、能量代谢及健康状况影响的差异。
分析棉籽油对花鲈肝脏脂质代谢及能量代谢的影响，为棉籽油在花鲈等肉食性鱼类配合饲料中的应用提供科学参考。
«——【·材料与方法·】——»
在广东的一实验基地，科学家试验选取200条初始体重为(62．40±0．01)g的健康花鲈，随机分为2个组，每组4个重复，每个重复25尾鱼。
2组分别饲喂基于实用基础，饲料配制的不同油源的等氮等能饲料，即大豆油组(SO组)和棉籽油组(CO组)饲料，试验期10周。
试验饲料组成、营养水平及饲料成本见表1，大豆油与棉籽油脂肪酸组成及2组饲料脂肪酸组成见表2。
2组饲料中均添加34%的鱼粉及4%的鱼油，其中n-3长链不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，包含二十碳五烯酸(EPA)，均满足生长需求量。
另外，在北京市昌平区南口镇，国家水产饲料安全评价基地室内循环水系统中进行另一种相对实验，以此来对比。
试验前花鲈于养殖系统中暂养2周以适应养殖环境，所用水为曝气井水。
暂养料为普通商业饲料，油源由5%鱼油和5%大豆油组成，蛋白质源为35%鱼粉、14%棉籽浓缩蛋白和10%豆粕.
其中粗蛋白质含量为43．01%，粗脂肪含量为12．56%。挑选个体大小均匀且健康的花鲈幼鱼。
初始体重为(62．40±0．01)g，消毒后随机分配到8个容量积为280L的圆锥形养殖桶中，每个养殖桶放养25尾，每组4个重复，进行10周养殖。
在养殖试验期间，每天进行2次(08:00和16:00)表观饱食投喂，记录死鱼数并进行称重，每天对投喂料盒进行称重，捞出残饵进行计数，计算饲料消耗量，记录总摄食量。
试验过程中，水温为24～26℃，pH为7．3～7．6，总氨氮浓度为0．2～0．4mg/L，亚硝酸盐浓度为0．3mg/L，溶解氧浓度为7mg/L。
在试验开始前，随机选取6尾饥饿24h的花鲈，作为初始鱼样品用于后续分析。
10周养殖试验结束后，每桶鱼饥饿24h后称重，从每个养殖桶中随机选取3尾鱼作为终末全鱼样品，进行全鱼样品水分、粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪含量分析。
每桶随机选取3尾鱼，使用浓度为300mg/mL的三氯叔丁醇将鱼麻醉后，分别测量其体长(自吻端至椎骨末端的长度)和体重，并进行采血，使用被抗凝剂(2%氟化钠+4%草酸钠)。
润洗过的1．5mL一次性注射器从鱼的尾静脉取血，使用离心机在4℃、4000r/min的条件下离心10min，分离出上层血浆，储存于－80℃冰箱中用于后续指标的测定。
将取血后的鱼进行解剖，对内脏团、肝脏、腹腔脂肪进行称重，剪出胴体称重。
在肝脏靠近胆管附近取2块用4%多聚甲醛进行固定，并用于后续组织病理学分析，取靠近肛门处的后肠组织，用甲醇醋酸固定液(60%甲醇+10%醋酸)进行固定。
并用于后续的组织病理，学分析，收集剩余的肝脏、肠道样品，置于无ＲNA酶的冻存管中，在液氮中速冻后存于－80℃冰箱，用于后续分析试验。
肝脏组织匀浆液使用生理盐水法制备，即取适量肝脏组织(50mg左右)于离心管中，按照组织重量(mg)。
体积(μL)=1∶9的比例加入9倍体积生理盐水，用组织匀浆机将其完全破碎混匀，并在4℃、3500r/min条件下离心10min。
吸取上清液，用考马斯亮蓝试剂，通过生物工程研究所，测定组织蛋白浓度，在－80℃条件下保存，用于后续指标测定。
全鱼及试验饲料营养水平分析均参照国标方法，分别采用105℃常压干燥法(GB/T6435—2006)。
凯氏定氮法(GB/T6432—1994)、550℃灼烧法(GB/T6438—2007)、酸水解全脂肪测定法(GB/T6433—2006)测定全鱼和饲料样品的水分、粗蛋白质、粗灰分、粗脂肪含量。
全鱼与饲料样品的总能使用IKA-C2000氧弹量热仪(IKA，德国)进行测定。肝脏样品真空低温冻干后研磨成粉末进行脂肪酸含量测定。
北京的科学家发现，肝脏及试验饲料脂肪酸，含量检测参照国标方法，中的水解法提取样品中脂肪酸。称取1g左右的冻干样品。
装入10mL容量瓶中，分别加2．5mL石油醚和苯，振荡混匀后静置2h后加入0．5mL浓度为2mol/L的氢氧化钾甲醇溶液。
再次静置0．5h，加入饱和氯化钠溶液至距离磨砂口1cm处，静置直至上清液出现澄清的状态。
将溶液过0．22μm有机滤膜，最后采用气相色谱仪上机检测，采用绝对值内标法对脂肪酸含量进行分析。
用南京一生物工程研究所进行测定，血浆免疫球蛋白、补体含量使用酶联免疫试剂盒，在多功能酶标仪上测定。
肝脏匀浆总胆固醇、甘油三酯含量采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，白细胞介素－10(interleukin-10，IL-10)。
白细胞介素－1β(interleukin-1β，IL-1β)含量使用酶联免疫试剂盒(江苏酶免实业有限公司)，在多功能酶标仪(TECANSPAＲK，奥地利)上测定。
每组取10尾鱼进行肝脏组织基因表达量检测，取50～100mg肝脏组织样品，在液氮中研磨成粉末。
并用从购入的试剂提取总ＲNA，在1%琼脂糖凝胶上电泳，以确保ＲNA的完整性，用分光光度仪测定吸光度(OD)260/280值，并记录ＲNA浓度。
同时用反转录试剂盒(KＲ118，天根生化科技有限公司)反转录为cDNA。以延伸因子－1α(EF-1α)作为花鲈的内参基因。
从GenBank中获得其序列，本试验所用的目标序列参考，实时荧光定量PCＲ结果通过2－△△Ct方法计算。
将浸泡固定液24h后的肝脏组织取出，进行脱水，石蜡包埋处理后用切片机切出厚度约6μm的组织切片。
经脱蜡操作后进行苏木精－伊红染色，另一块肝脏组织从固定液中取出后使用刀片切至适宜大小。
用磷酸盐缓冲液(PBS)润洗后使用梯度浓度的蔗糖溶液进行脱水操作，用OTC包埋，切片10μm，进行油红O脂肪染色。
将固定24h的后肠组织取出，经脱水、包埋、切片、脱蜡处理后分别进行HE染色与阿尔星蓝染色，组织切片均使用，奥地利)进行扫描观察，试验结果用平均值±标准误表示。
数据先使用GraphPadPrism9．00先分别进行标准检验其正态分布，对不符合正态分布的数据进行转换，再进行独立样本t检验，以P＜0．05为显著性标准，数据图均绘制。
«——【·结果与分析·】——»
饲料对花鲈生长性能、形体指标、全鱼营养组分、营养转化率及经济效益的影响如表3所示。
2组之间存活率、增重率、特定生长率和摄食率均无显著差异(P＞0．05)，CO组饲料系数显著低于SO组(P＜0．05)。
2组之间形体指标(肥满度、脏体比、肝体比、胴体比和腹脂率)、全鱼营养组分(水分、粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪含量及总能)。
营养转化率(蛋白质效率、蛋白质沉积率和脂肪沉积率)和经济效益(养殖成本和经济利润指数)均无显著差异(P＞0．05)。
大豆油与棉籽油饲料，对花鲈能量代谢的影响如表4所示，CO组血浆T3、T4含量略低于SO组。
但2组之间无显著差异(P＞0．05)，由图1可知，CO组肝脏cAMP含量显著低于SO组(P＜0．05)。
同时肝脏内基础代谢，相关的基因环磷腺苷效，应元件结合蛋白(CＲEB)和腺苷酸活化蛋白激酶，的相对表达量显著低于SO组(P＜0．05)。表明CO组花鲈能量代谢速率降低。
大豆油与棉籽油饲料，对花鲈肝肠组织病理学，及免疫的影响由图2，可知，肝脏的苏木精－伊红与油红染色结果显示。
肝脏呈现正常，与轻微脂肪沉积2种表型，SO组和CO组内，10个肝脏表型为无明显异常，2个肝脏表型为轻微的脂肪沉积，即17%.
由图3可知，后肠的苏木精－伊红与阿尔星蓝染色结果显示，后肠皱襞组织排列紧密，且皱襞内细胞分布均匀，无明显的炎症异常现象。
如表5所示，2组之间血浆肝脏促炎性，因子TNF-α和IL-1β含量以及抑炎因子IL-10含量均无显著差异(P＞0．05)，其实在以前的青岛一水产基地和西安的一水产地就有对比。
此外，2组之间血浆，IgM和C3含量均无显著差异(P＞0．05)。
大豆油与棉籽油饲料对花鲈血浆肝功能和脂质代谢指标的影响如表6所示。
CO组血浆AKP、ALT活性显著高于SO组(P＜0．05)，2组之间血浆AST活性无显著差异(P＞0．05)。
CO组血浆TC、TBA含量，显著高于SO组(P＜0．05)，2组之间血浆TG、HDL-C和LDL-C含量无显著差异(P＞0．05)。
大豆油与棉籽油饲料，对花鲈肝脏脂代谢指标和胆汁，酸代谢途径及相关基因表达的影响如表7所示，CO组肝脏TG和TC含量显著低于SO组(P＜0．05)。
由图4可知，CO组肝脏脂肪生成［乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、脂肪酸合成酶(FASN)］、脂肪分解［单酰基甘油脂肪酶(MAGL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)］。
以及脂肪酸β氧化［过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAＲα)］、脂肪细胞分化［过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAＲγ)。
CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)］、胆固醇代谢［载脂蛋白Bα(APOBα)］、脂肪淤积［脂肪酸结合蛋白1(FABP1)、单酰基甘油酰基转移酶2α(MGAT2α)］。
脂肪细胞转化［脂滴包被蛋白2(PLIN2)］和胆汁酸代谢相关基因［胆固醇7α－羟化酶(CYP7A1)］mＲNA相对表达水平均显著低于SO组(P＜0．05)。
组成的影响如表8所示，CO组肝脏总饱和脂肪酸含量高于SO组(P＞0．05)。
其中硬脂酸(C18∶0)含量显著高于SO组(P＜0．05);CO组肝脏总单不饱和脂肪酸显著低于SO组(P＜0．05)。
其中油酸(C18∶1n-9)、棕榈油酸(C16∶1)、鳕鱼酸(C20∶1)和神经酸(C24∶1)含量均显著低于SO组(P＜0．05);CO组肝脏。
总n-3多不饱和脂肪酸含量显著低于SO组(P＜0．05)，其中亚麻酸(C18∶3n-3)含量显著低于SO组(P＜0．05)。
CO组肝脏总n-6多不饱和脂肪酸含量低于SO组(P＞0．05)，其中十八碳三烯酸(C18∶3n-6)和二十碳三烯酸。
(C20∶3n-6)含量显著低于SO组(P＜0．05);2组之间肝脏总脂肪酸含量无显著差异(P＞0．05)。
«——【·结语·】——»
与大豆油饲料相比，花鲈摄食棉籽油饲料可降低饲料系数。
花鲈摄食棉籽油与大豆油饲料后存活率、形体指标、全鱼营养组分、肝脏炎症因子和免疫因子含量均无显著差异。
与大豆油饲料相比，花鲈摄食棉籽油饲料后肝脏cAMP含量显著降低，且基础代谢相关基因(CＲEB、AMPK)表达下调。
棉籽油完全替代花鲈饲料中，大豆油会通过降低花鲈机体基础能量和脂肪分解代谢，从而提高饲料代谢能、降低饲料系数，最终提高生长性能和经济效益。
