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由于目前人类心脏组织供应有限，且成人心肌细胞(CM)无法在培养中扩增，因此开发能够生成功能性人类心肌细胞和工程化心脏组织(ECT)的先进体外平台对于促进心脏再生、药物发现、心脏毒性测试和疾病建模至关重要。对于再生疗法来说，一个可靠的悬浮平台对于从人类诱导多能干细胞(hiPSC)大规模生产工程心脏组织至关重要。
基于此，来自美国奥本大学的Elizabeth A. Lipke团队比较了使用基于支架的工程组织微球分化方法形成的ECT和使用流行的无支架聚集体平台形成的ECT的生产和功能。该研究研究探索了心脏微球和聚集体的分化潜力和收缩功能属性，揭示了它们的独特特性，并深入了解了平台选择对心脏组织工程的影响。
相关研究成果以“Hydrogel microsphere stem cell encapsulation enhances cardiomyocyte differentiation and functionality in scalable suspension system”为题于2024年10月1日发表在《Bioactive Materials》上。
1.与无支架（聚合物）平台相比，支架支撑（微球）平台的均匀性和可重复性得到增强
作者首先主要讨论了通过微球平台进行的心肌细胞的分化和功能与传统的无支架聚集体平台进行比较的结果。通过使用微流体系统，可以在化学定义的培养基中快速（每分钟100万细胞）、高密度（每毫升3000万、4000万、6000万细胞）地将人类诱导多能干细胞（hiPSCs）包裹在聚乙二醇-纤维蛋白原（PEG-fibrinogen, PF）水凝胶微球中。与聚集体相比，微球在尺寸和形状的一致性、初始和批次间的维持方面表现出了优势（图1C至E）。
此外，微球在心肌细胞的含量和每个初始hiPSC的心肌细胞数量上都有显著提高。微球在收缩和舒张速度上的显著优势，微球的功能随着培养时间的增长而改善，而聚集体的功能则保持不变。此外，微球还显示出对β-肾上腺素信号的改善响应和钙瞬变传播的均匀性（图1F和G）。总的来说，微球平台在增强均匀性、可重复性及批次间一致性方面相较于传统的无支架聚集体平台的优势，尤其是在心肌细胞的分化效率和功能性方面表现出显著的改进，这些结果强调了微球平台在规模化生物制造心脏组织方面的潜力。
图1 在化学定义的条件下，应用支架支撑（微球）和无支架（聚集体）方法进行 3D hiPSC 组织生产
2.细胞在两个平台上均保持增殖能力和多能性
随后，作者探讨了在心脏分化启动之前，微球和聚集体两种平台上的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）保持了良好的增殖能力和多能性的情况。通过使用特定的染色方法，如Phalloidin染色（标记肌动蛋白丝，即F-actin），Ki67（细胞增殖标记）、Oct4（多能性标记）和Collagen I（胶原蛋白I，用于观察细胞外基质的产生），进行了免疫荧光染色，验证了两个平台中hiPSCs的这些特性（图2）。在两个平台中，hiPSCs均能够在微球和聚集体的3D微环境中保持其未分化状态，表达细胞增殖标记Ki67和多能性标记Oct4，显示出细胞具有良好的增殖潜能和多能性维持。这一结果对于后续的心脏分化至关重要，因为一个稳定的未分化状态是高效分化的前提（图2）。
此外，通过染色结果观察到，虽然两个平台的hiPSCs都能在分化前保持其多能性和增殖能力，但是在聚集体平台中观察到了Collagen I的沉积，而在微球平台中未观察到显著的Collagen I表达。这说明在微球平台中，细胞外基质的环境与聚集体平台存在差异，可能对细胞的微环境控制和后续分化产生影响（图2）。
图2 维持微球和聚集体内 HiPSC 的增殖能力和多能性
3.微球封装增强了批次间的一致性并提高了细胞产量
心脏分化开始后，两个平台中的细胞开始生长，形成连续组织（图3A）。从第0天开始，聚集体平台中微球和聚集体的归一化生长面积在批次之间的变化大于微球，尤其是在第1天和第3天，如图3B、C所示。对于Un-Arc 16Facs IIhiPSC系，微球的归一化生长面积直到第3天保持一致，并且与第0天相比，第5天显著增加了68%。另一方面，与第0天相比，聚集体的归一化生长面积在第3天显著增加了85%。总的来说，微球平台为每个初始hiPSC提供了显著更高的总细胞数。
图3 在分化过程中，封装细胞和聚集体随时间持续生长，微球在第10天表现出明显更高的标准化细胞计数
4.微球平台中观察到hiPSC-CM的心脏分化效率增强和线粒体组织成熟
在此部分，作者详细讨论了微球技术如何提升人类诱导多能干细胞（hiPSCs）向心肌细胞（CMs）的分化效率，并促进更为成熟的线粒体组织。通过使用特定的染色和成像技术，研究显示微球平台的hiPSCs在心脏分化和细胞功能上表现优于传统的聚集体平台。首先，实验结果显示，在微球平台中，hiPSCs表现出更高的心肌细胞分化效率，与聚集体相比，心肌细胞的产量和质量均得到显著提升。在微球平台中，心肌细胞的含量在第10天时显著高于聚集体平台，心肌细胞数量比初始hiPSC数量的比例也更高（图4A-B）。结果说明微球平台通过提供更加均一和控制的微环境，有效促进了心肌细胞的分化和成熟。微球平台的hiPSC-CMs展示了更为成熟的线粒体组织，与聚集体平台相比，线粒体分布更均匀，且在细胞中的位置更为合适（图4C-D），表明微球平台不仅改善了心肌细胞的分化效率，还促进了细胞代谢和能量产生机制的成熟，这对于心肌细胞的功能发挥至关重要。最后，通过细胞形态分析，发现微球平台中的hiPSC-CMs具有更大的细胞面积和更长的肌节长度，这些特征表明细胞结构更接近成熟的心肌细胞（图4E-I）。总的来说，这些发现强调了微球平台在制备适用于疾病模型和再生医学应用的高质量心肌细胞方面的潜力。
图4 与聚集平台相比，微球平台中的心脏含量和产量更高，并且在产生的hiPSC-CM中具有更多结构成熟的线粒体组织
5.第10天，微球的收缩速度比聚集体更快，并且其收缩速度随着时间的推移持续增加
在第10天时，微球平台的心肌细胞表现出比聚集体更快的收缩速度。具体数据显示，微球的心肌细胞在收缩和舒张方面的速度都显著高于聚集体，其中收缩速度是聚集体的四倍，舒张速度则是九倍（图5A-5D）。结果表明，微球平台能够提供更优化的微环境，促进心肌细胞功能的提升。随着培养时间的增加，微球中的心肌细胞收缩功能进一步增强。研究记录了微球平台的心肌细胞在长期培养过程中的功能变化，显示出其收缩和舒张速度随时间持续提高，而聚集体平台的这些参数则未见显著变化（图5E-5F），该结果强调了微球平台在支持心肌细胞成熟和提高其功能性方面的潜在优势。
图5 微球表现出增强的收缩功能，并在长期培养过程中进化为收缩速度更快的组织
6.微球hiPSCs-CMs β-肾上腺素能信号传导可能比聚集体更成熟，并表现出适当的电生理特性
作者进一步研究了微球平台和聚集体平台中人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）在β-肾上腺素信号应答和电生理特性方面的差异。实验结果表明，微球平台的hiPSC-CMs在对β-肾上腺素激动剂（异丙肾上腺素）和拮抗剂（普萘洛尔）的响应上表现出更成熟的信号特征。相较于聚集体平台，微球平台的心肌细胞在药物刺激下显示出更显著的收缩频率变化，其中频率在添加异丙肾上腺素后增加了124%，在添加普萘洛尔后降低了61%（图6A-6D），表明微球平台可能更有效地支持心肌细胞β-肾上腺素受体的成熟和功能表达。随后，通过光学映射技术评估了两个平台心肌细胞的电生理性质。微球平台的hiPSC-CMs在自发去极化率、钙瞬变持续时间和传播速度方面表现出较为均一和稳定的性能。微球的钙瞬变持续时间（在50%和80%复极化时）分别为554ms和1075ms，而聚集体的这些值分别为418ms和890ms，显示出微球在电生理特性上的一致性和成熟度（图6E至6H）。
图6 微球和聚集体对药物刺激作出适当反应
7.比较转录组分析显示微球平台中心肌细胞分化和收缩功能增强
最后，通过对微球和聚集体平台进行的转录组分析，对比了两种方法在心肌细胞分化效率和功能性方面的基因表达差异（图7）。利用高通量RNA测序技术比较了两个平台的基因表达差异，发现微球平台的心肌细胞在分化和功能相关基因的表达上具有显著的优势。转录组分析显示，与聚集体相比，微球平台在心肌细胞分化关键基因和收缩功能相关基因的表达上更为活跃和成熟，表明微球平台更有利于心肌细胞的成熟和功能表达。
图7 微球和聚集平台显示出相似的转录组趋势，但微球中的基因表达水平更高
综上，该研究通过对比微球和聚集体两种平台，展示了微球平台在人类诱导多能干细胞（hiPSCs）心肌分化、功能表现、及转录组特性方面的优势。研究结果表明，微球技术能够提高心肌细胞的分化效率、增强其收缩功能和电生理稳定性，并通过提供一致的细胞微环境，显著改善批次间的重复性和均匀性。这些发现强调了微球平台在高效生成功能性心肌细胞方面的潜力，为心脏疾病模型的发展和再生医学应用提供了有力的技术支持。
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