实验目的

在进行一些细胞实验前，确定细胞数目和存活率，以确定细胞质量和取样体积。

计数工具

血细胞计数板计数法使用的是一种有两个激光蚀刻网格的工具（见图1，2），用来帮助在简单的光学显微镜下计数取样细胞，得到的数据可以用来推算出实验样品中细胞的数目。

基本原理

血细胞计数板，又称为血球计数板或玻璃计数板（见图1，2），最多用于早期医院检验科进行血细胞计数，在生物实验室也得到广泛应用。根据蚀刻网格的不同，又分为汤麦氏和希利格式（见图3），本文以汤麦氏为例。

血球计数板的中央有两个细胞计数池，上面有激光蚀刻形成的网格。网格由9个大方格构成，角上的四个方格每一个被进一步分成16个较小的中方格，中央的大方格被分为25个较小的方格，每一个中方格被进一步分为16个小方格，在每个细胞计数池的远端是上样口，待计数的细胞样品从此处加入。（见图4）

在医学检验中，4角的四个大方格被作为白细胞计数区，中央大方格作为红细胞计数区，用于同时对不同的血液细胞进行计数。在生物实验室，一般只使用4角的四个大方格即可。

02细胞计数板实验步骤

准备计数板——01

用75％酒精清洁计数板后，把盖片覆在计数板上面。

制备细胞悬液——02

1、将培养瓶中的培养液倒入干净试管中，向试管中加入0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA混合消化液1mL，静置3~5分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，轻轻进行吹打，制成细胞悬液，备用。

2、若为悬浮细胞，即可直接吸取细胞悬液，进行适当稀释后，备用。

3、取0.4％台盼蓝染色液0.1mL，加入细胞悬液0.9mL，混合后染色3~5 分钟。（台盼蓝工作浓度为0.04%，染色时间不宜超过10min）

制备细胞计数板——03

1.轻轻吹打混匀悬液，使用单道移液器吸取10~15μL 悬液，沿盖片边缘加入，静待液体通过毛细作用充满整个计数室。

2.将细胞计数板放入显微镜的载物台，等待细胞沉淀下来，选择合适的物镜进行观察。

细胞计数方式、原则以及特殊情况——04

1.显微镜下观察细胞，一般情况下推荐对4角的4个大方格（即图6中红色区域）中全部细胞进行计数，根据公式N=（n/4）×10^4×稀释倍数 个/ml 计算细胞密度。注：每个大方格中至少都要有20-50个细胞。

2.计数原则：

仅计算未被台盼蓝染色的活细胞。

为了更快、更好地进行细胞计数，推荐使用S形计数路径（见图5）。

对于跨线的细胞：记上不记下，记左不记右。

3.特殊情况：

如果每个大方格内少于5个细胞，就需将样品重新离心，用更小的体积重悬细胞。

如果细胞有相互重叠，或者因密度太大难以区分，就需再次稀释样品到更大的体积。