自咸丰九年（1859年）下半年起，曾国藩率领的湘军经过整顿后卷土重来，再度向驻守安徽的太平军发起进攻。期间，太平天国池州守将韦俊叛变投敌，归降清军，使得太平军在该地区的防御力量受到严重削弱。
与此同时，江南大营也加紧了对天京的围攻，原本稍显缓和的战局再次陷入紧张态势。到了咸丰十年一月，曾国藩的湘军成功将安庆团团围困。
进入咸丰十年初，洪仁玕、李秀成等太平军重要将领在芜湖召开军事会议，制定了一项精心策划的战略：集中精锐兵力打击江南大营。他们派遣一支奇兵突袭杭州，以此诱使江南大营分兵救援，待敌人分散兵力后，迅速撤回奇兵，并以优势兵力突然合围江南大营。
同年正月，李秀成率军出征，二月便一举攻克杭州。江南大营果然中计，立即派兵前往救援。然而，李秀成随即主动放弃杭州，火速回师天京。
闰三月，李秀成与陈玉成等五路太平军合力猛攻江南大营。至闰三月中旬，太平军再次成功摧毁江南大营，清军统帅和春与张国梁仓皇逃窜至丹阳。
太平军乘胜追击，张国梁在撤退途中不慎落水溺亡。而和春则逃至无锡浒墅关，见四面楚歌，最终选择自缢身亡。自此，江南大营彻底瓦解，再未能重建。
咸丰十年四月，洪秀全于天京召开重要会议，庆祝成功击破江南大营的胜利。同时，会议还决定展开新一轮军事行动：太平军将东征苏南地区，随后分兵为江南、江北两路大军沿江西上，目标直指武汉，以解安庆之围。这一系列行动被称为第二次西征。会后，李秀成率部东征，接连攻克苏州等多处州县，其军队一度逼近上海，成功开辟了以苏州为中心的苏南根据地，并建立了“苏福省”。
同年五月，李秀成首次进军上海。然而，盘踞上海的外国势力此时撕下了所谓“中立”的伪装，公然协助清军对抗太平军。美国冒险家华尔纠集一批外籍亡命之徒组建洋枪队，向太平军发起进攻，但屡战屡败，华尔本人也身负重伤。正当太平军迫近上海城之际，英法联军从天津调防至上海，协同清军进行抵抗。
面对新的敌情，李秀成选择撤出上海地区，退守苏州。
进入咸丰十一年初，陈玉成与李秀成联合指挥第二次西征，旨在救援被围困的安庆，确保天京的安全。按照计划，陈玉成率领北路军沿长江北岸进军，从安徽进入湖北；而李秀成则率南路军经江西入鄂，双方约定于三月会师武汉。二月时，陈玉成的北路军已攻克距离汉口仅一百六十里的黄州，形势一片大好。
然而，此时在汉口租界的英国参赞巴夏礼赶到黄州，以欺骗手段劝阻太平军攻打武汉，声称若贸然进攻，可能导致孤军深入，面临被夹击的风险。加之李秀成的南路军行动迟缓未能如期抵达，陈玉成最终决定放弃进攻武汉的计划，转而回师救援安庆。此举使得太平军错失了夺取武汉的战略良机。
李秀成对湘军的力量有过高评估，因此调整战略路线，从徽州进入浙江，再转攻江西与湖北，直至咸丰十一年五月才抵达武汉外围。
然而，此时陈玉成早已率军回援安庆。由于李秀成未能按时会师，加上陈玉成匆忙撤退，导致第二次西征计划失败。
随后，曾国荃率领湘军猛攻安庆，在安庆外围与太平军展开激烈战斗。咸丰十一年八月，安庆不幸失守，守城的一万六千余名太平军全部战死，无一人投降。
湘军攻入城内后展开了持续三日的血腥屠城，无论男女老少均未能幸免于难。安庆的陷落，致使天京丧失了西部的关键屏障，给太平天国带来了极为不利的战略影响。
然而，在东部战线，太平军却捷报频传。咸丰十一年四月，李秀成之堂弟李世贤领军进入浙江，短短半年间便相继收复浙东、浙西广大区域。
同年八月，李秀成自江西挥师入浙，至十一月底再度拿下杭州，顺利将浙江与苏南根据地融为一体，构建起天京东部坚固的防御体系和重要的物资补给基地。
这一成就对太平天国后期的存续与发展起到了至关重要的作用。
苏、浙两省作为中国最富庶的地区之一，也是清政府赋税收入和粮饷供给的关键区域。曾国藩对此惊呼：“如今浙、苏两省膏腴之地尽为敌方所有，其巢穴已稳固，根基已深。”
尽管太平军在东部战场取得胜利，但西部形势仍迅速恶化。安庆失守后，陈玉成退回庐州，局势愈发艰难。
同治元年（1862年）初，陈玉成派遣部将陈得才、赖文光等人率军远征西北，自己则留守庐州，与湘军展开血战长达三个月。同年三月，他弃城突围时，被反复无常的团练首领苗沛霖诱骗至寿州城内逮捕，并被押送至清军将领胜保的营地。
胜保命其下跪，陈玉成怒目而视，斥责道：“你曾是我手下败将，我岂能向你下跪？真是不知自重！”
胜保试图劝降，陈玉成勃然大怒，厉声喝道：“大丈夫死便死矣，何必多言！”
陈玉成表现出了大义凛然、宁死不屈的精神，于同年五月在河南延津英勇就义，年仅26岁。
庐州失守和陈玉成的牺牲导致太平天国西部战场全面溃败，湘军乘势东进，步步逼近天京，使天国局势愈发恶化。
天京事变后，洪秀全的精神状态日渐低落，封建思想和宗教迷信却日益严重。他逐渐脱离群众，不理朝政，对实际情况也缺乏了解。他曾一度将“太平天国”更名为“上帝天国”，随后又改为“天父天兄天王太平天国”。为了巩固自身地位并削弱李秀成、陈玉成的势力，他滥封王爵，使各派势力互相牵制。到太平天国灭亡前夕，竟封了两千七百多位王爷。这种做法引发了诸多矛盾，导致政令难以统一执行。
在太平天国的地方政权和基层政权中，混入了不少异己分子。
苏浙地区的地主团练武装气焰嚣张，这些封建势力盘踞一方，继续欺压百姓。更有甚者，部分人潜入地方政权和太平军内部，暗中与清军勾结，企图从内部瓦解太平天国政权。
然而，李秀成及其他将领对此熟视无睹，一味采取“招抚”政策，妥协迁就，这引发了广大军民的强烈不满和反对。因此，在太平天国统治区域内，农民抗粮抗租的斗争频繁发生，杀死催租派捐乡官的事件也屡见不鲜。
1861年10月，曾国藩受命掌管苏、浙、皖、赣四省军务后，将安庆作为指挥中心统筹全局。他部署了三路大军对太平军展开攻势：
首先，在1861年底，曾国藩派遣其弟曾国荃率领湘军主力向天京发起进攻。
其次，同年12月，左宗棠被派往江西并进军浙江。左宗棠是湖南湘阴人，举人出身，一直以来都是湘军的坚定支持者，并且在1860年就已经独立招募和统领一支湘军与太平军作战。
最后，在1862年三四月间，李鸿章奉命带领淮军从安庆乘坐英国轮船抵达上海，与外国势力勾结，共同针对苏南地区的太平军。
李鸿章来自安徽合肥，进士出身，自1858年起成为曾国藩的幕僚，并于1861年在曾国藩的支持下扩编安徽地方武装力量，按照湘军模式组建了淮军，这支部队也成为镇压太平天国运动的重要力量之一。
与此同时，以英、法、美为主的外国侵略军以上海为据点加紧军事部署。1862年1月，中外反动势力在上海设立了“中外会防公所”，专门策划防御上海的计划。当时，英法军队在上海的人数已达到数千人规模，而华尔指挥的洋枪队也扩充至五千人，更名为“常胜军”。这些外国势力与清军相互配合，在上海周边地区对太平军发动进攻。
同治元年年初，李秀成率领五路大军从杭州、苏州出发，采取水陆并进的方式，发起第二次攻打上海的军事行动。
然而，遭遇了李鸿章淮军与外国势力的联合反击。在奉贤南桥镇爆发激烈战斗，法国海军司令卜罗德被击毙，太平军也不得不暂时撤出南桥镇。
同年四月中旬，李秀成亲自指挥大军对侵略军展开反攻，相继收复嘉定、青浦等县城，并在青浦生擒“常胜军”副统领法尔思德。
正当李秀成在上海郊区取得重大胜利之际，曾国荃率领湘军包围了天京，天京的局势变得异常危急。洪秀全在一天之内连续发出三道命令，催促李秀成立刻回师救援。无奈之下，李秀成只能暂时搁置攻打上海的计划，火速赶回天京。
从八月二十日至十月五日，李秀成在天京城外指挥作战，与湘军展开了长达四十六天的激烈血战。湘军难以抵挡太平军的攻势，甚至曾国荃也在战斗中面部受伤。
然而，由于太平军粮草短缺、御寒衣物匮乏，难以持续进行攻坚作战，李秀成最终主动停止了进攻。按照洪秀全的战略部署，他决定渡江北上，进攻皖北，进而挺进湖北，试图夺取武汉，以此切断湘军的后方补给线，迫使湘军撤出天京。这一战略被称为太平天国的“进北攻南”策略。
同治二年春天，李秀成率军转战皖北。然而，皖北地区正值饥荒，太平军将士因饥饿和疾病大量减员。同年五月，湘军攻占了雨花台。洪秀全紧急命令李秀成立即回师救援天京。李秀成率部返回江南时，恰逢江水暴涨，加之粮食严重匮乏，导致士兵死伤惨重，超过十万人，太平军实力大受削弱，士气也受到了严重影响。
10月22日晚，郜永宽与戈登、程学启进一步商讨投降的具体条件。淮军提出以活捉李秀成或击杀谭绍光作为投降的前提。
至24日，郜永宽等八人杀害了慕王谭绍光，随后开城投降，苏州由此落入敌手。然而，仅仅数日后，郜永宽等八人被李鸿章处决。11月2日，无锡失守，黄子隆遭俘虏，不久后遇害。在攻陷苏州与无锡之后，淮军分兵两路：一路向浙江嘉兴推进，另一路则准备进攻常州。
淮军在清除江阴、常熟、无锡境内的太平军残余力量后，在常州外围集结。
同治三年三月十七日，淮军水陆并进，成功占领常州西南的陈渡桥，切断了太平军通往金坛、丹阳的道路。次日，常州城外的重要据点全部失守，太平军被迫全面退守城内。随后，淮军在城壕外修筑长墙，并调整炮位靠近城墙，同时于夜间秘密架设浮桥跨越护城河。
四月五日，淮军发动总攻，集中火力对准城墙缺口猛烈轰击。至六日，南城与北城各被轰塌十余丈，淮军趁机从缺口突入城内。太平军与入侵之敌展开激烈的巷战，最终淮军虽付出沉重代价，但仍占领了常州城。四月八日，提督冯子材率部攻陷丹阳，至此苏南各城均落入清军之手。
与此同时，湘军各路部队不断向东推进，曾国荃部已兵临天京城下。而在浙江战场，李世贤、黄呈忠、范汝增等部也面临东西两面敌军的夹击。同治元年四月十二日，清军联合英法侵略军攻占宁波。七月七日，洋将马惇率领“常胜军”一支部队抵达宁波，与“常捷军”共同进犯余姚，威胁绍兴。
八月，黄呈忠、范汝增部发起反击，一度收复慈溪，对宁波构成威胁。“常胜军”统领华尔受李鸿章命令，率千人自上海驰援宁波，于七月十六日重新夺回慈溪，但在此役中华尔身负重伤而亡。同治二年正月，中外反动联军再次发动攻势，于正月二十六日攻占绍兴，二月二日攻陷萧山，前锋直逼杭州城下。
在浙西战区，新任命的浙江巡抚左宗棠于同治元年一月中旬率领部队从皖南进入浙江。不久之后，他接连攻占了开化、常山、遂安和江山等地。同年五月四日，左宗棠率军从江山推进至衢州，其麾下的湘军也抵达汤溪、兰溪一带，对金华形成了直接威胁。
自五月起，李世贤部在龙游、汤溪、兰溪一线对左宗棠的湘军展开了顽强的抵抗与反击。到了同年秋季，浙江布政使蒋益澧带领近万名湘军从广西赶到浙江，进一步增强了左宗棠的军事力量。
而在太平军方面，由于曾国荃部正全力围困天京，李世贤受命回师救援，导致留守浙江的太平军兵力大幅削减。
借此机会，左宗棠于同年冬季对浙西地区的太平军发动了新一轮攻势。同治元年十一月十二日，严州失守；同治二年正月十日，汤溪陷落；十二日，龙游和兰溪相继被攻破。
十三日，太平军主动撤离金华。随后不到十天的时间里，湘军又连续攻克武义、永康、东阳、义乌、诸暨和桐庐等地，并于二月六日开始对杭州西南方向的富阳展开进攻。
富阳作为湘军进攻杭州的必经之地，地理位置十分重要。县城背靠长江，面向山脉，右侧有一条溪流阻隔，地势十分险要。太平军在占领杭州后，立即在此修筑防御工事和堡垒。自二月下旬起，湘军蒋益澧部开始对富阳发起进攻，但屡次被太平军守将汪海洋部击退。
直至八月二十七日，在“常捷军”千余人的协助下，湘军才成功攻占富阳。随后，湘军沿钱塘江一路推进直逼杭州，同时分兵攻打余杭（位于杭州西部），意图切断杭州太平军的退路。双方在杭州与余杭之间展开了激烈的争夺战。
到了同治二年底，苏南战场局势急剧恶化，苏州、无锡相继失守。淮军不仅继续向常州发起进攻，还分出一支军队南下进入浙江，对杭州东北的重要城市嘉兴展开攻势。嘉兴周边的平湖、乍浦、海盐、澉浦、海宁、桐乡等地的太平军将领纷纷投降或叛变。同治三年二月，嘉兴最终失守，坚守杭州的太平军陷入敌军三面包围的困境。
随着苏南和浙江根据地的丢失，天京失去了东南方向的重要屏障，导致军需物资和粮食供应中断，进一步陷入被动局面。同治二年十月十五日，巡抚曾国荃与提督萧庆衍率领部队进驻天京城东的孝陵卫。此时，天京城仅有太平门和神策门仍与外界保持联系。
1863年11月10日，李秀成从丹阳返回天京。次日，他向洪秀全提出了一个重要建议。鉴于湘军防御工事坚固、包围严密，而天京城内粮草匮乏、外援无望，李秀成提议放弃天京，转而经江西、湖北与陈得才、赖文光部会合，以图东山再起。然而，洪秀全拒绝了这一建议，坚持固守天京，并开始怀疑李秀成的忠诚。
此时的洪秀全已逐渐脱离实际事务，既不过问军民之事，又对他人汇报的情况充耳不闻，反而沉迷于宗教幻想，寄希望于上帝的庇佑。
天京被围困的局面日益严峻。洪秀全下令全城军民严防死守，颁布严苛命令：任何人私自拆阅城外清军投来的信件，全家抄斩；知情不报者将被视为同谋。
在浙江战场，太平军为了摆脱被动局面，相继组织了多次突围行动。第一批约八万人于同治三年（1864年）一月从溧阳、广德、宁国出发，进入天目山区并挺进闽赣地区；第二批约二十万人由李世贤率领，从浙江德清向江西进发；第三批约三万人从丹阳经皖南向江西突围时遭遇敌人伏击，损失惨重。
曾国荃为加速攻城，将围困天京的湘军人数增至五万，进一步加剧了天京的危机。
同治三年一月二十一日，湘军成功攻占了紫金山顶的天保城。到了二月二十四日，曾国荃率领的部队进驻太平门与神策门外，对天京形成了全面合围。
此时，天京城内已经断粮，局势极为严峻。李秀成请求洪秀全下令筹措粮食以安抚人心。
然而，洪秀全颁布诏书称：“全城军民皆可食用甜露，以此养生。”鉴于城中无粮的困境，李秀成建议将城内的百姓放出城外。
但洪秀全严厉斥责李秀成：“你竟不顾及国家体面，敢让朕的弟妹外出游荡！所有臣民必须遵从朕的旨意，多准备甜露，食之即可饱腹长生，无需再奏请此事。”
二月，曾国荃完成对金陵的合围后，尝试使用云梯攻城，但未能成功。
三月起，湘军在朝阳、神策、金川门外挖掘了十多处地道，计划炸毁城墙。太平军则一方面组织力量从城内反向挖掘，破坏敌方地道，另一方面修建月城，为城墙被轰塌后的持续抵抗做准备。
同治三年四月二十七日（1864年6月1日），天王洪秀全因病去世，享年五十一岁。此后，天京内部人心更加动摇。五天后，全体文武官员扶持幼天王洪天贵福继位，而一切军政事务则由忠王李秀成全权负责。
6月30日，湘军成功占领紫金山地保城，这一战略高地使得他们能够俯瞰并监控南京城内的动态。随后，湘军在龙脖子山麓修建了数十座炮台，持续对城内发起昼夜不停的攻击，压制太平军的火炮力量，同时为攻城提供掩护。此外，他们在龙脖子山麓与城墙之间填充大量芦苇和蒿草，并覆盖沙土，堆积至与城墙齐平的高度，以便于攻城行动。与此同时，湘军还在距离城墙十余丈的地方日夜挖掘地道，计划通过爆破轰塌城墙。
经过半个月的准备，湘军的攻城工作已全面就绪。李秀成察觉到湘军即将发动总攻，在7月15日深夜派遣千余人伪装成湘军士兵试图冲出城外破坏太平门附近的地道，但最终被湘军识破，未能得逞。
次日，也就是同治三年六月十六日（1864年7月19日），湘军主力部队在太平门外集结待命。
午时，随着地雷的引爆，城墙瞬间被撕开一个巨大的豁口，湘军如潮水般涌入城内。
尽管太平军凭借枪炮拼死抵抗，给湘军造成了惨重损失，但仍未能成功封堵缺口。湘军突破太平门后，迅速分作四路向城内深处推进，双方展开了血腥残酷的白刃战。直至黄昏，天京各城门陆续被湘军占领。
在天京城破之际，李秀成为保护幼天王，含泪告别母亲，舍弃家室，独自带领幼天王突围求生。然而，由于各城门均已被湘军严密把守，多次突围尝试均告失败。
深夜三更之后，李秀成将自己的战马让给幼天王骑乘，自己则换乘幼天王那匹劣马再次尝试突围。他英勇冲锋在前，最终带领幼天王从城墙倒塌的缺口处冲出城外。
然而，湘军紧追不舍，李秀成与幼天王在混乱中失散。李秀成因坐骑无法继续前行，且天色渐亮，只得弃马逃入荒山顶的一座破庙藏身。后来被乡民发现并秘密藏匿于村中，但因奸细告密，于六月十九日被湘军俘获。
李秀成在被俘后于囚笼中撰写了数万字的供词。然而，在完成这份供词的当晚，他便遭到了曾国藩的处决，时年仅41岁。
湘军在攻陷天京后进行了大规模的劫掠，随后将城内部分建筑焚毁，意图掩盖其罪行。整座城市陷入火海，大火持续燃烧至七月二十五日才逐渐熄灭。
城内的所有太平军将士，或战死沙场，或被湘军屠杀，亦或是选择集体自焚，十余万将士无一人投降。
湘军对天京的围困持续了两年多的时间，在这漫长的过程中，因病去世的人数超过一万，而在战斗中牺牲的也有九千人，同样承受了巨大的损失。
同治三年六月，幼天王洪天贵福成功从天京突围，并在江苏东坝与前来接应的洪仁玕汇合，随后退至皖南广德固守。到了七月十二日，洪仁玕抵达湖州，打算与黄文金等人合力坚守此地。
然而，湖州面临着左宗棠部湘军和李鸿章部淮军的猛烈进攻。尽管守城的太平军英勇抵抗，多次击败清军，但守将陈学明却于七月二十五日向清军投降，这使得太平军的处境愈发艰难。
洪仁玕、黄文金等人在无奈之下，于二十七日夜晚撤离湖州，退守至广德。二十八日晚，他们护送幼天王离开广德，途经宁国与昌化等地。然而，在行军途中，黄文金不幸负伤牺牲。洪仁玕继续保护幼天王，经过开化、常山等区域，于八月二十二日抵达江西玉山，计划与先前进入江西的李世贤、陈炳文以及汪海洋等部队会合，随后再前往湖北与陈得才部汇合，试图重振太平天国的辉煌。
然而，出乎意料的是，李世贤等部队已经转移到赣、粤、闽三省交界的地带。洪仁玕率众追赶，在九月九日到达石城杨家牌时遭遇敌人突袭，幼天王与洪仁玕等人被迫分散。洪仁玕向北撤退至广昌，在白水镇被敌军俘虏。而幼天王则逃至石城的荒山中，最终也被敌人搜捕抓获。
同年十月二十日，年仅十六岁的幼天王在南昌惨遭凌迟处决。洪仁玕被俘后，于同治三年十月同样在南昌英勇就义。临刑前，他慷慨激昂地吟诗一首，痛斥清朝统治者的暴行，并坚信革命事业将由后来者继承。
诗中的最后几句写道：
“我今即永逝，一语贻后贤：天国祚虽斩，复生待他年。”
