摘要：过去 20 年，尤其是近十年，干细胞与再生医学领域取得了众多重要进展。本文系统综述了该领域的主要发现，涵盖多能干细胞（PSCs）的产生与分化、不同培养类型中的干细胞维持，以及三维（3D）细胞技术和未来干细胞应用。具体包括多能细胞来源、体内直接重编程技术、PSCs 衍生细胞类型及遗传记忆影响、基因组修饰诱导多能性、重编程因子组合载体构建、小分子和遗传信号通路增强多能性、RNA 信号诱导细胞重编程、化学物质诱导和增强多能性、诱导多能干细胞（iPSCs）的多能性维持和基因组稳定性、无饲养层和无异种培养环境、干细胞生物学中的生物材料应用、3D 细胞技术、3D 生物打印、下游干细胞应用以及当前干细胞和再生医学中的伦理问题，旨在全面呈现干细胞研究与开发的重要进展，为相关领域研究提供参考。
关键词：进展；应用；干细胞；技术
一、引言干细胞研究在过去几十年中取得了显著进展，为再生医学带来了巨大希望。多能干细胞具有自我更新和分化为多种细胞类型的能力，这使其在疾病治疗、药物筛选和基础生物学研究等方面具有广阔的应用前景。本文将详细阐述多能干细胞研究的历史、机制、技术及其应用，以及当前面临的挑战和未来发展方向。
二、多能干细胞研究的历史里程碑（一）早期干细胞发现造血干细胞的发现1961 年，Till 和 McCulloch 通过实验直接测量了正常小鼠骨髓细胞的辐射敏感性，为造血干细胞的研究奠定了基础。他们的研究表明，造血干细胞具有自我更新和分化为各种血细胞的能力，这一发现开启了干细胞研究的大门。（二）胚胎干细胞的突破小鼠胚胎干细胞的建立1981 年，Evans 和 Kaufman 首次从小鼠囊胚中成功分离出胚胎干细胞（ES 细胞），这些细胞在体外能够无限增殖并保持多能性，为后续研究提供了重要的模型。人类胚胎干细胞的获得1998 年，Thomson 等人成功从人类囊胚中分离出胚胎干细胞系，这一成果引发了全球范围内对干细胞研究的热潮，因为人类胚胎干细胞具有分化为人体各种细胞类型的潜力，有望用于治疗多种疾病。（三）诱导多能干细胞的诞生山中伸弥的开创性工作2006 年，Takahashi 和 Yamanaka 通过将四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c - Myc）导入小鼠成纤维细胞，成功诱导出具有多能性的细胞，即诱导多能干细胞（iPSCs）。这一发现打破了传统观念，证明了体细胞可以被重新编程为多能干细胞，为干细胞研究和再生医学带来了革命性的变化。2007 年，他们又成功将人类体细胞诱导为 iPSCs，进一步推动了该领域的发展。三、多能干细胞的机制（一）多能性的分子调控网络核心转录因子的作用Oct4、Sox2 和 Nanog 等转录因子在维持多能干细胞的自我更新和多能性方面发挥着关键作用。它们通过形成复杂的转录调控网络，调节众多下游基因的表达，从而控制细胞的命运。例如，Oct4 和 Sox2 能够结合到特定的 DNA 序列上，激活或抑制与多能性相关基因的转录。信号通路的调控Wnt、BMP 和 LIF 等信号通路参与了多能干细胞的自我更新和分化调控。Wnt 信号通路的激活可以促进多能干细胞的自我更新，而 BMP 信号通路在一定程度上抑制细胞分化。LIF 通过激活 STAT3 信号通路，维持多能干细胞的未分化状态。这些信号通路之间相互作用，形成一个精细的调控网络，确保多能干细胞在适当的条件下保持多能性或分化为特定的细胞类型。（二）细胞重编程机制转录因子诱导重编程在 iPSCs 的产生过程中，导入的转录因子通过与基因组中的特定位点结合，改变染色质的结构和基因表达模式，从而将体细胞重编程为多能干细胞。这一过程涉及到大规模的基因表达变化，包括激活多能性相关基因和抑制体细胞特异性基因。例如，Oct4、Sox2、Klf4 和 c - Myc 等转录因子能够协同作用，开启多能性基因的表达程序，同时关闭与体细胞身份相关的基因表达。研究表明，这些转录因子可以结合到特定的 DNA 调控元件上，招募染色质重塑复合物，使染色质处于开放状态，便于转录机器的结合，从而促进多能性相关基因的转录。此外，转录因子还可以通过与其他转录调节因子相互作用，形成复杂的转录调控网络，进一步稳定多能性状态。表观遗传修饰的变化细胞重编程过程伴随着广泛的表观遗传修饰改变，包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等。在体细胞中，特定基因区域的 DNA 甲基化和组蛋白修饰模式决定了其基因表达状态。而在重编程为 iPSCs 的过程中，这些表观遗传标记需要被重新编程。例如，DNA 甲基化水平在重编程早期会发生显著变化，一些与体细胞分化相关的基因区域的甲基化程度降低，而多能性基因区域的甲基化程度则发生动态调整。组蛋白修饰如 H3K4me3 和 H3K27me3 等也会发生重塑，以适应多能性细胞的基因表达需求。染色质重塑复合物参与了染色质结构的动态调控，使基因组区域在可及性和转录活性之间发生转换。这些表观遗传修饰的变化对于建立和维持 iPSCs 的多能性至关重要，它们共同作用，确保了细胞命运的转变和多能性的稳定。代谢重编程的影响细胞重编程还涉及代谢途径的重编程。体细胞和多能干细胞具有不同的代谢特征，在重编程过程中，细胞的代谢方式会发生改变。例如，体细胞通常依赖于氧化磷酸化产生能量，而多能干细胞更倾向于糖酵解代谢。这种代谢转变为细胞提供了快速合成生物大分子所需的中间产物和能量，以支持细胞的快速增殖和多能性维持。研究发现，代谢重编程与转录因子的活性以及表观遗传修饰密切相关。一些代谢产物如 α - 酮戊二酸和琥珀酸等可以作为表观遗传酶的辅因子，影响 DNA 甲基化和组蛋白修饰的动态平衡，进而调节基因表达和细胞命运。此外，代谢重编程还可能通过影响细胞内的氧化还原状态，调节信号通路的活性，从而促进重编程过程。例如，高水平的活性氧（ROS）在一定程度上可以促进细胞重编程，但过高的 ROS 则会对细胞产生毒性。因此，细胞需要在重编程过程中精确调控代谢途径，以维持适当的氧化还原平衡，确保重编程的顺利进行。四、多能干细胞的技术进展（一）iPSCs 的生成技术改进无病毒载体诱导方法早期 iPSCs 的生成主要依赖于病毒载体将转录因子导入体细胞，但病毒整合到基因组中可能带来潜在的基因突变风险。近年来，研究人员开发了多种无病毒载体的诱导方法，如使用 episomal 质粒、Sendai 病毒和 mRNA 等。例如，通过 episomal 质粒转染体细胞，可以在不整合到基因组的情况下表达重编程因子，从而降低了基因异常的风险。Sendai 病毒是一种 RNA 病毒，不会整合到宿主基因组，且在细胞内能够高效表达重编程因子，提高了 iPSCs 的生成效率。mRNA 转染技术则可以直接将编码重编程因子的 mRNA 导入体细胞，快速激活细胞内的重编程程序，并且 mRNA 的半衰期较短，减少了长期表达带来的不良影响。这些无病毒载体诱导方法的发展，使得 iPSCs 的生成更加安全、高效，为其在临床应用中的进一步推进提供了有力支持。小分子化合物的应用小分子化合物在 iPSCs 的生成和调控中发挥着越来越重要的作用。研究发现，一些小分子化合物可以替代部分转录因子，或者增强转录因子的活性，从而提高重编程效率。例如，CHIR99021 是一种 GSK - 3 抑制剂，能够激活 Wnt 信号通路，促进多能干细胞的自我更新和重编程。丙戊酸（VPA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，它可以改变染色质的结构，使基因组处于更有利于重编程的状态，与其他转录因子协同作用时，能显著提高诱导 iPSCs 的效率。此外，维生素 C 被发现可以增强重编程过程中的表观遗传重塑，促进多能性相关基因的表达，同时减少因氧化应激导致的细胞损伤，从而提高 iPSCs 的生成质量。通过组合使用不同的小分子化合物，研究人员还能够进一步优化重编程过程。例如，将 CHIR99021 与其他信号通路抑制剂或激活剂联合应用，可以更精准地调控细胞内的信号网络，提高重编程的成功率和效率。而且，小分子化合物的使用为开发更安全、更有效的 iPSCs 生成方法提供了可能，因为它们可以避免因病毒载体整合或转录因子过表达带来的潜在风险。除了在 iPSCs 生成中的应用，小分子化合物在维持 iPSCs 的多能性和诱导其分化方面也具有重要作用。一些小分子化合物可以模拟细胞外信号，调节细胞内的信号通路，从而维持 iPSCs 处于未分化状态。在诱导分化时，特定的小分子化合物可以引导 iPSCs 向特定的细胞谱系分化，例如，通过添加小分子化合物可以诱导 iPSCs 分化为神经细胞、心肌细胞或肝细胞等，为细胞替代治疗和药物筛选提供了丰富的细胞来源。随着研究的不断深入，越来越多具有潜在重编程调节作用的小分子化合物被发现和筛选出来，它们的作用机制也在不断被揭示。这将有助于进一步完善 iPSCs 技术，使其在再生医学、疾病建模和药物研发等领域发挥更大的作用。同时，小分子化合物的应用也为开发个性化的干细胞治疗方案提供了可能，通过选择合适的小分子化合物组合，可以根据患者的具体需求定制 iPSCs 的生成和分化过程，提高治疗的有效性和安全性。在未来，对小分子化合物的研究可能会集中在以下几个方面：一是寻找更高效、特异性更强的小分子化合物，以进一步提高重编程效率和质量；二是深入研究小分子化合物与细胞内分子靶点的相互作用机制，为合理设计新的小分子化合物提供理论依据；三是探索小分子化合物在大规模生产 iPSCs 及其衍生细胞中的应用，以满足临床和工业需求；四是研究小分子化合物在改善 iPSCs 免疫原性和体内整合能力方面的潜力，为其临床应用提供更全面的解决方案。 