酵母异源互补在植物离子转运蛋白
和分泌蛋白研究中的应用
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在植物基因克隆与功能验证中，作为模式生物的酿酒酵母被广泛应用。酵母异源互补法是通过营养缺陷型突变菌株中转入的载体上外源基因的表达来回补营养缺陷表型，以达到基因克隆或验证基因功能的目的的方法。这一方法常被用于研究植物体内一类重要的蛋白——离子转运蛋白的活性，且目前已在拟南芥、水稻、番茄等多个物种中被应用。不同物种中的铁、磷、锌等金属离子的转运蛋白基因被克隆。然而，此方法作为基因功能验证的重要手段，仍需结合蛋白组学、功能组学等手段对基因进行更加全面的分析。
本篇将介绍Coolaber研发的采用经典的酵母异源互补法的三款方法简便、可靠的试剂盒：酵母钾离子转运活性检测试剂盒、酵母钠离子转运活性检测试剂盒和信号肽分泌酵母检测试剂盒，旨在为研究离子转运系统和信号肽的伙伴提供一份称手的研究工具。详情请参看下文。
酵母钾离子转运活性检测试剂盒
1. 植物钾离子转运
钾离子（K+）是活细胞必需的常量营养元素，是胞质溶胶中含量最丰富的阳离子。K+在植物的基本生命过程以及增强植物对各种胁迫的耐受性方面发挥着重要作用，如酶激活、渗透调节、膜电位的维持、细胞的膨压产生、植物运动、花粉发育、细胞呼吸和细胞信号传导、光合作用[1]。
植物根细胞从土壤中吸收K+和体内运输K+的过程由植物K+转运蛋白和通道蛋白等K+转运组分完成。许多编码K+转运相关蛋白的基因已经在拟南芥、水稻、大麦、玉米、棉花等植物中被克隆和鉴定，而在研究过程中，酵母互补实验方法因实验周期较短、操作简便被广泛用于K+转运功能鉴定[2-7]。如Han等人通过酵母互补实验证明了KUP7介导钾离子缺陷型酵母菌R5421的K+转运（图1）[4]。
图1 KUP7介导酵母菌K+转运
注：（A）KUP7和AKT1对含有不同K+浓度的AP培养基上的K+缺陷型酵母突变体R5421钾离子转运的介导。使用酵母菌株R757作为阳性对照。（B）外源NH4+对KUP7在酵母中的K+转运活性的抑制。液体AP培养基含有1 mM K+和不同的NH4+（0和10 mM）。数据点显示为平均值±SE（n=3）。
基于酵母互补实验的原理，Coolaber公司研发团队研发出的一款专门用于在酵母中对研究蛋白进行钾离子活性检测的试剂盒（YH5001），试剂盒中包含了实验所需的全部试剂、菌株和载体，操作流程简单高效。
2. 解决方案原理
R5421酿酒酵母菌株为K+缺陷型菌株，其内源的两个钾离子转运基因（TRK1, 2）被突变，在文献中也称为CY162，多用于K+转运蛋白的鉴定试验中，也可用于钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定[8-9]。Transformation marker为：Ura3，Leu2。该菌株可以在含有100 mM KCl的培养基中正常生长，在含有5-10 mM KCl的培养基中生长缓慢，当培养基中KCl浓度低于0.5 mM，R5421细胞停止生长[5, 10]。
pYES2是酿酒酵母蛋白高效表达载体，筛选标记为Ura3。GAL1启动子，需要利用半乳糖诱导蛋白表达。将K+转运蛋白基因X构建到pYES2载体中（pYES2-X），将其转化R5421感受态细胞，X蛋白就会介导酵母从培养基中吸收钾离子，进而使得R5421酵母菌能够在低钾AP培养基中正常生长。
3. 解决方案简介
A. 产品基础信息
B. 产品成分
C. 产品实验流程
载体构建→酵母转化→阳性克隆鉴定（选做）→钾离子转运活性检测
4. 解决方案实验案例
图2 使用酵母钾离子转运活性检测试剂盒（coolaber，YH5001）验证AKT1钾离子转运活性
注：构建了pYES2-AKT1质粒作为实验组；对照组为pYES2。AKT1为拟南芥钾离子通道[11]。
参考文献
[1] Nestrerenko EO, Krasnoperova OE, Isayenkov SV. Potassium Transport Systems and Their Role in Stress Response, Plant Growth, and Development. Cytology and Genetics, 2021, 55(1): 75-92
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[4] Han M, Wu W, Wu WH, Wang Y. Potassium Transporter KUP7 Is Involved in K+ Acquisition and Translocation in ArabidopsisRoot under K+-Limited Conditions. Molecular Plant. 2016, 9(3): 437-466
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[6] Wang YR, Wang Y, Li B, Xiong CM, Eneji AE, Zhang MC, Li FJ, Tian XL, Li ZH. The Cotton High-Affinity K+ Transporter, GhHAK5a, Is Essential for Shoot Regulation of K+ Uptake in Root under Potassium Deficiency. Plant&Cell Physiology. 2019, 60(4): 888-899
[7] Wang XH, Li JF, Li F, Pan Y, Cai D, Mao DD, Chen LB, Luan S. Rice Potassium Transporter OsHAK8 Mediates K+ Uptake and Translocation in Response to Low K+ Stress. Frontiers in Plant Science. 2021, 12: 730002
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[11] Sentenac H, Bonneaud N, Minet M, Lacroute F, Salmon JM, Gaymard F, Grignon C. Cloning and expression in yeast of a plant potassium ion transport system. Science. 1992, 256(5057): 663-665
酵母钠离子转运活性检测试剂盒
1. 植物钠离子转运
钠离子（Na +）是盐渍化土壤中分布最广泛的可溶性阳离子。在大多数植物中，低钠有利于维持植物渗透压和促进植物生长[1-2]。然而在盐胁迫过程中，胞质Na+的过度积累破坏了几个重要的生理过程，包括细胞周期、酶反应和光合作用，从而导致植物生长迟缓和细胞发育停滞[3-4]。因此，胞质溶胶中的Na+的排出对植物的耐盐性至关重要。
研究表明，植物排出胞质溶胶中多余Na+的过程主要由Na+转运蛋白完成。在研究过程中，酵母互补实验方法因实验周期较短、操作简便被广泛用于蛋白Na+转运功能鉴定[5-9]。如Zhou等人通过酵母异源互补实验证明，在SOS1存在下，共表达CBL10和CIPK8提高了酵母的耐盐性。这与已报道的重要耐盐性组分（CBL10/SOS3、SOS2和SOS1）的耐盐能力相当，揭示了CBL10在拟南芥中介导的耐盐新途径[5]。
图3 酵母细胞中CIPK8对SOS1活性的调节[8]
基于酵母互补实验的原理，Coolaber研发了在酵母中检测钠离子转运活性的试剂盒（YH5002），试剂盒中包含了实验所需的全部试剂、菌株和载体，操作流程简单高效。
2. 产品原理
AXT3K酿酒酵母菌株为Na+缺陷型菌株，其缺失了内源的质膜Na+逆向转运蛋白NHX1以及Na+外排蛋白NHA1和ENA1-4，丧失了转运Na+的能力[10]。AXT3K多用于Na+转运蛋白的鉴定试验中，也可用于Na+通道或钠钾离子泵的鉴定。该菌株对Na+特别敏感，在含有50 mM NaCl的培养基上生长，其生长受到明显抑制。
pYES2是酿酒酵母蛋白高效表达载体，筛选标记为Ura3。GAL1启动子，需要利用半乳糖诱导蛋白表达。将Na+转运蛋白基因X构建到pYES2载体中(pYES2-X)，将其转化AXT3K感受态细胞，X蛋白就会介导酵母向培养基中排出多余的钠离子，进而使得AXT3K酵母菌能够在高钠AP培养基中正常生长。
3. 产品简介
A. 产品基础信息
B. 产品成分
C. 产品实验流程
载体构建→酵母转化→阳性克隆鉴定（选做）→钠离子转运活性检测
4. 产品实验案例
图4 SOS1在不同钠离子浓度AP培养基上的功能分析(本公司结果验证)
注：构建pYES2-SOS1-998作为实验组；对照组pYES。SOS1为拟南芥质膜Na+/H+逆向转运蛋白。
参考文献
[1]Maathuis FJM. Sodium in plants: perception, signalling, and regulation of sodium fluxes. Journal of Experimental Botany. 2014, 65: 849-858
[2]Subbarao GV, Ito O, Berry WL, Wheeler RM. Sodium—a functional plant nutrient. Critical Reviews in Plant Sciences. 2003, 22: 391-416
[3]Niu XM, Bressan RA, Hasegawa PM, Pardo JM. Ion homeostasis in NaCl stress environments.
Plant physiology. 1995, 109: 735-742
[4]Hasegawa PM, Bressan RA, Zhu JK, Bohnert HJ. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology. 2000, 51: 463-499
[5] Yin XC, Xia YQ, Xie Q, Cao YX, Wang ZY, Hao GP, Song J, Zhou Y, Jiang XY. The protein kinase complex CBL10–CIPK8–SOS1 functions in Arabidopsis to regulate salt tolerance. Journal of Experimental Botany. 2020, 71: 1801-1814
[6] Yan JW, Yang L, Liu Y, Zhao YD, Han T, Miao XF, Zhang AY. Calcineurin B-like protein 5 (SiCBL5) in Setaria italicaenhances salt tolerance by regulating Na+ homeostasis. The Crop Journal. 2021, 10: 234-242
[7] Steinhorst L, He GF, Moore LK, Schültke S, Schmitz-Thom I, Cao YB, Hashimoto K, Andrés Z, Piepenburg K, Ragel P, et al. A Ca2+-sensor switch for tolerance to elevated salt stress in Arabidopsis. Developmental Cell. 2022, 57: 2081-2094
[8] Zhang YM, Zhou JQ, Ni XP, Wang QR, Jia YT, Xu X, Wu HY, Fu P, Wen H, Guo Y, Yang GH. Structural basis for the activity regulation of Salt Overly Sensitive 1 in Arabidopsis salt tolerance. Nature Plants. 2023, 9: 1915-1923
[9] Wang YH, Pan CC, Chen QH, Xie Q, Gao YW, He LL, Li Y, Dong YL, Jiang XY, Zhao Y. Architecture and autoinhibitory mechanism of the plasma membrane Na+/H+ antiporter SOS1 in Arabidopsis. Nature Communications. 2023, 14: 4487
[10] Quintero FJ, Ohta M, Shi HZ, Zhu JK, Pardo JM. Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na+ homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002, 99: 9061-9066
信号肽分泌酵母检测试剂盒
1. 产品背景
YTK12是一个蔗糖酶外泌缺陷型酿酒酵母，该酵母广泛用于分析鉴定分泌蛋白的信号肽。蔗糖酶转化基因SUC2能够将棉子糖或蔗糖转化成酵母可以利用的葡萄糖，酵母信号肽追踪系统中使用的pSUC2载体含有蔗糖酶基因suc2，但其为丧失了分泌活性的缺失信号肽序列的基因。YTK12酵母菌株则为suc2基因缺陷型菌种，无法在以棉子糖为单一碳源的YPRAA培养基上正常生长。只有将具有分泌活性的信号肽序列连接在pSUC2载体蔗糖酶基因suc2的N端，转化入YTK12酵母菌株中，才能使蔗糖转化酶正常分泌，YTK12酵母才能将棉子糖转化为葡萄糖，在YPRAA培养基上正常生长(Jacobs et al 1997, Oh et al 2009)。同时，可以用显色反应来进一步验证结果，因为SUC2的酶活产物可以将2,3,5-三苯基四唑氯(TTC)还原为不溶性的红色1,3,5-三苯基甲酸(TPF)，该方法已被广泛用于研究信号肽的功能(Oh et al 2009, Song et al 2015)。
2. 产品原理和流程
A. pSUC2 载体构建
(1) 将待验证基因的信号肽区域SP构建到pSUC2载体EcoRI & XhoI之间，即为实验组pSUC2-SP；
(2) pSUC2载体信息如下：
EcoRI: 5’ TCCAAGCTCGGAATTTTAATTAAGAATTC 3’
XhoI: 5’ CTC GAG GTT CTC CCT ATA GTG AGT CGT AT 3’
图5 pSUC2 载体示意图
(3) pSUC2载体克隆检测引物
pSUC2F: GGTGTGAAGTGGACCAAAGGTCTA
pSUC2R: CCTCGTCATTGTTCTCGTTCCCTT
B. 酵母转化
(1) 取感受态细胞100 µL于冰上融化的，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次) 10 µL，PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30 ℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
(2) 将管放42 ℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
(3) 5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30 s弃上清。
(4) ddH2O 50 µL重悬，涂布CMD-W平板。
(5) 将上述平板倒置于30℃培养箱内培养3 d。
C. 信号肽分泌检测
(1) 上述平板中，分别随机挑取若干个克隆，用SK2420的方法以及pSUC2-F/R引物进行PCR验证；
(2) 选择1个鉴定的阳性克隆，分别划线到YPRAA平板和CMD-W平板上，30℃培养2~3 d，观察酵母菌对棉子糖的利用情况验证信号肽的功能；
(3) 同时再选择1个鉴定的阳性克隆，接种于5ml的CMD-W液体培养基，30℃，220 rpm，振荡培养24h后，12000 rpm离心1 min收集菌体；
(4) 弃上清，加入1 mL无菌水重悬沉淀，12000 rpm离心1 min收集菌体；
(5) 重复步骤4一次；
(6) 加入1 ml 10%蔗糖溶液，重悬菌体；
(7) 加入1ml 1%TTC溶液，混匀后35℃水浴10 min，室温放置5 min，观察颜色变化并拍照。
注：若阳性对照未变红，可再次35℃水浴适当时间。（参考图6）
图6 TaLr35PR5信号肽功能验证(Zhang et al 2018)
3. 产品结果与分析
本研究采用pSUC2酵母分泌系统来验证信号肽的分泌功能，Avr1b的信号肽已经被证明具有分泌功能，因此将pSUC2-Avr1b作为阳性对照，pSUC2空载体作为阴性对照。实验组需要构建pSUC2-SP信号肽重组载体，然后与对照同时分别转入酵母菌株YTK12。
实验结果分析：阳性对照YKT12[pSUC2-Avr1b]可以在YPRAA培养基上生长，阴性对照YKT12[pSUC2]不能在YPRAA平板上生长；阳性对照YKT12[pSUC2-Avr1b]分泌蔗糖酶能把蔗糖水解成单糖，单糖与TTC反应变成红色且不溶于水的氯化三苯基四氮唑。阴性对照YKT12[pSUC2]不分泌蔗糖酶，因此不能与TTC发生显色反应 （图7）。如实验组pSUC2-SP与阳性对照结果一致，则表明该基因的信号肽具有分泌功能。反之，则表明该基因的信号肽不具有分泌功能，结果示例如下。
注：阴性对照弱生长为正常现象，是YKT12本身背景斑。
图7 Avr1b信号肽功能验证(Dou et al 2008)
参考文献
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[3]Oh S-K, Young C, Lee M, Oliva R, Bozkurt TO, Cano LM, Win J, Bos JI, Liu H-Y, van Damme M. In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2. Plant Cell, 2009, 21: 2928-2947
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[5]Zhang J, Wang F, Liang F, Zhang Y, Ma L, Wang H, Liu D. Functional analysis of a pathogenesis-related thaumatin-like protein gene TaLr35PR5 from wheat induced by leaf rust fungus. BMC Plant Biol, 2018, 18: 76
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END
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图文|Coolaber技术部&研发部
编辑|Coolaber技术部
