ACLF三阶段造模法：构建理想的ACLF小鼠模型

前言

“慢加急性肝衰竭（ACLF）主题月评”是中国慢（加急）性肝衰竭联盟受《国际肝病》编辑部邀请，制作的ACLF相关学术月评专栏。本专栏每月以ACLF某一特定领域为主题展开，旨在普及ACLF的概念及意义、帮助读者快速了解有关领域的进展。希望本专栏对无论是需要了解相关领域热点的肝病专家及研究人员，或是需要实用知识、活跃于临床一线的医务工作者，均能有所裨益。

本期月评将深入地介绍慢加急性肝衰竭肝衰竭小鼠模型的最新进展。此外，还对本月（2025.01.21-2025.02.20）Pubmed上更新的ACLF相关重要文献进行简评。

关于作者：

中国慢（加急）性肝衰竭联盟（Chinese Acute-on-chronic liver failure Consortium，Ch-CLIF-C）是由上海交通大学附属仁济医院消化内科李海教授牵头，由全国14家三甲医院感染科/肝病中心共同参与成立的肝病科研合作团队，致力于探索慢加急性肝衰竭（ACLF）的发病机制、制定基于高循证等级的乙肝高流行区ACLF诊断标准。目前团队开展了全球已报道入组数最多的ACLF前瞻性多中心队列研究“CATCH LIFE”（Chinese AcuTe-on-CHronic LIver FailurE），包含2个大型队列（入组2600的探索队列与入组1370例的验证队列）。

本期责任编辑

项晓刚教授

上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科主任医师、研究员，主要研究方向为危重型病毒性肝炎肝衰竭的发病机制和治疗策略研究，以第一负责人承担课题12项，国自然3项，曾获上海市医学科技进步一等奖、华夏医学奖一等奖、中华医学科技奖三等奖、上海市青年科技英才奖、上海市优秀青年学术带头人、上海市公卫优秀学科带头人等，主要成果发表在Journal of Hepatology、Journal of Clinical Investigation、Theranostics等知名专业期刊上。

ACLF是一类在慢性肝病基础上发生的以急性肝功能失代偿、肝外器官损伤和短期高死亡率为主要临床特征的严重临床综合征，是我国肝衰竭的主要类型。自1995年首次提出概念，至今已30年，虽然目前关于ACLF在世界范围尚未形成统一的诊断标准，但ACLF作为一种不同于急性肝衰竭和慢性肝衰竭的临床综合征已被广泛认可。近年来，ACLF疾病描述中的慢性肝病基础、肝内或肝外的急性损伤、急性肝功能失代偿、肝外器官功能衰竭、短期高死亡率以及病程具有可逆性等关键特征，东西方已在逐渐缩小分歧、趋近共识，只是描述这些关键特征的评价标准还存在一定差异，亟需开展涵盖不同病因和不同人群的大样本、全球多中心的前瞻性研究，推进东西方在ACLF领域内实现认知的统一。

目前，由于缺乏能够有效模拟临床ACLF患者病程全过程的动物模型，很多基础研究无法在动物模型上有效开展，极大地限制了ACLF发病机制的研究，以及后续药物干预靶点的筛选。关于ACLF发病机制的认知还相对不完善，很多机制探讨还停留在基于临床数据统计分析后的科学推理和假说层面。因此，完整模拟ACLF病程的动物模型不仅有助于深入研究ACLF的机制，更能够为新药新靶点的筛选提供有效的平台。

项晓刚教授团队在Journal of Hepatology上发表的题为“Interleukin-22 ameliorates acute-on-chronic liver failure by reprogramming impaired regeneration pathways in mice”的研究（Xiang X, et al. J Hepatol. 2020 Apr;72(4):736-745.）。该项研究创新设计了一种“ACLF三阶段造模法”，成功实现了在小鼠模型中完整模拟大多数ACLF患者的核心病程，并且该模型也能很好地模拟ACLF病程中出现的肝外器官损伤如肾功能损伤和多器官功能衰竭，具有合适的生存周期用于干预研究。“ACLF三阶段造模法”能够很好地标准化，取材容易，简便快速，易于推广，为ACLF的相关机制研究和新治疗靶点筛选提供了可靠的平台。应用这种ACLF小鼠模型，发现肝内STAT1/STAT3磷酸化激活失衡导致肝再生受抑制是ACLF病程持续进展的核心机制，同时发现细胞因子IL-22可以逆转肝内STAT1/STAT3激活失衡促进肝再生，改善ACLF小鼠预后。

图1. 研究摘要图

当前已有的ACLF模型，常用的有两大类型：一类是基于D-氨基半乳糖/LPS腹腔注射，主要有用人血白蛋白（HSA）诱导的免疫损伤性肝硬化大鼠模拟慢性损伤，之后联合D-氨基半乳糖/LPS腹腔注射模拟急性肝脏损伤，该模型的存在的问题是HSA诱导期间大鼠的死亡率非常高，达到20%-30%，急性损伤后，大鼠存活时间较短（16.1±3.7 h），进行相关干预性研究有些局限；此类模型也有使用猪血清（PS）诱导免疫损伤性肝硬化+D-氨基半乳糖/LPS，或者使用CCl4诱导慢性肝损伤联合D-氨基半乳糖/LPS，同样是生存周期短，而且LPS并不能有效模拟ACLF患者体内活细菌感染引发的全身性炎症（Systemic Inflammation）。另一类是在大鼠或小鼠中行胆管结扎术（Bile-duct ligation, BDL）联合LPS腹腔注射，能够模拟高胆红素血症，但是单纯的结扎胆管与ACLF的发病机制并不一致，不能反映ACLF病程的本质。这两类常用ACLF模型均不能完整地模拟大多数ACLF患者核心病程，限制了进一步深入研究ACLF的发病机制，也限制了ACLF治疗新靶点的筛选。

该研究中根据ACLF的临床特征，将大多数ACLF患者的核心病程分为三个阶段：1）长期慢性肝损伤；2）急性肝损伤；3）细菌感染导致的系统性炎症反应及肝外器官损伤。根据ACLF患者病程这三个核心阶段，选择C57B6J小鼠，创新设计了“ACLF三阶段造模法”，分别是：慢性肝损伤阶段（CCl4 0.2 mL/Kg，2次/周，腹腔注射，共8周）、急性肝损伤阶段（CCl4 0.4 mL/Kg，第9周第1天腹腔注射1次）和细菌感染阶段（第9周第2天，肺炎克雷伯杆菌500-1000 CFU腹腔注射），首次在ACLF造模中尝试引入活细菌感染，成功实现了在小鼠模型中完整模拟大多数ACLF患者的核心病程，构建了一种理想的ACLF小鼠模型，为ACLF的相关机制研究和新治疗靶点筛选提供了可靠的平台。

图2. ACLF“三阶段造模法”

通过ACLF小鼠模型的研究，我们发现ACLF模型小鼠在急性肝损伤后，与正常小鼠相比，STAT1/STAT3磷酸化活性存在失衡现象，ACLF小鼠以STAT1激活为主，而正常小鼠以STAT3为主。在ACLF模型小鼠中，细菌感染可以上调STAT1表达，加剧STAT1/STAT3活性失衡，上调抑肝再生基因的表达（p21等），下调促肝再生基因的表达（Cyclin D1等），进一步抑制肝再生，这一点也在ACLF临床病例的肝组织中得到验证，为阻断ACLF病程进展提供了全新靶点。

白介素（IL）-22属于IL-10家族的一类细胞因子，主要通过与IL-10R2和IL-22R1受体结合激活STAT3磷酸化，发挥抗凋亡、促增生、抗氧化和抗微生物感染等作用。IL-22由免疫细胞分泌，但免疫细胞无IL-22R1受体，而IL-22R1受体主要在上皮细胞表达，如肝、肾和肠道粘膜细胞等，因此，IL-22对免疫细胞无作用，而对肝细胞具有很好的靶向作用。通过ACLF小鼠模型，证实IL-22是逆转肝内STAT1/STAT3磷酸化活性失衡，促进肝再生，改善ACLF小鼠存活率，提示IL-22可通过逆转肝内STAT1/STAT3活性失衡，靶向促进肝再生改善ACLF预后，为ACLF临床治疗提供了一种可行方案。

01

Pose E, Jiménez C, Zaccherini G, et al. Simvastatin and Rifaximin in Decompensated Cirrhosis: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2025 Feb 5. doi: 10.1001/jama.2024.27441. IF=63.1

简述：本研究旨在评估辛伐他汀联合利福昔明是否能改善失代偿期肝硬化患者的预后。该研究自2019年1月至2022年12月期间，在14家欧洲医院对失代偿期肝硬化患者开展了一项双盲、安慰剂对照的3期临床试验。患者被随机分配接受辛伐他汀（20毫克/天）加利福昔明（1200毫克/天）（n=117），或外观相同的安慰剂（n=120），疗程12个月，同时均接受标准治疗，并根据 Child-Pugh分级B或C级进行分层。主要终点是符合慢加急性肝衰竭标准、与器官衰竭相关的肝硬化严重并发症的发生率。次要终点包括肝移植或死亡，以及肝硬化并发症（腹水、肝性脑病、静脉曲张出血、急性肾损伤和感染）的复合终点。

在随机分组的237名受试者中（Child-Pugh分级B级：n=194；C级：n=43），72%为男性，平均年龄为57岁。两组在慢加急性肝衰竭的发生方面无差异（治疗组17.9% vs. 安慰剂组14.2%；HR：1.23；95%CI：0.65-2.34；P=0.52）；肝移植或死亡（治疗组18.8% vs. 安慰剂组24.2%；HR：0.75；95%CI：0.43-1.32；P=0.32）；或肝硬化并发症的发生（治疗组42.7% vs. 安慰剂组45.8%；HR：0.93；95%CI：0.63-1.36；P=0.70）。两组不良事件发生率相似（P=0.59），但治疗组有3名患者（2.6%）发生了横纹肌溶解。

简评：该研究的结论是在标准治疗基础上加用辛伐他汀联合利福昔明并不能改善失代偿期肝硬化患者的预后。目前尚无有效治疗方法可预防肝硬化严重并发症的发生，多项回顾性研究报道辛伐他汀和利福昔明已显示出对肝硬化有益的作用。

2018年，西班牙研究者Dinesh Mani Tripathi等在肝硬化大鼠的研究中，发现给予LPS可以促进ACLF的发展，加重了慢性肝病的并发症并缩短了生存时间；辛伐他汀可减轻ACLF大鼠LPS引起的炎症和肝损伤，提示辛伐他汀可能用于改善晚期慢性肝病患者预后。2022年，Nadim Mahmud等通过大型回顾性队列研究中，发现在肝硬化人群中，他汀类药物暴露与ACLF的发生减少有关，研究的结果提示他汀类药物在未来预防肝硬化患者发生ACLF方面可能发挥有希望的作用。2023年，Nadim Mahmud等课题组进一步通过回顾性队列研究发现使用他汀类药物与ACLF导致的短期（28天和90天）死亡率降低相关，建议未来还需开展前瞻性研究，以进一步明确他汀类药物疗法在降低肝硬化患者ACLF相关发病率和死亡率方面的相对安全性与有效性。

这项JAMA上的最新研究间接回答了上述问题，通过前瞻性随机对照研究发现辛伐他汀并不能改善失代偿期肝硬化患者的预后，但是对于代偿期肝硬化患者是否能够降低ACLF发生和进展仍需开展前瞻性研究来验证。

02

Verma N, Roy A, Valsan A, et al. Liver Dysfunction and Systemic Inflammation Drive Organ Failures in Acute Decompensation of Cirrhosis: A Multicentric Study. Am J Gastroenterol. 2025 Jan 1;120(1):182-193. IF=8

简述：这是一项多中心前瞻性研究，旨在确定肝硬化急性失代偿（AD）患者进展为ACLF的关键预测因素并构建预测模型，为临床治疗提供指导。传统认为肝硬化分为代偿期和失代偿期，近年研究揭示失代偿期有不同表型，AD可能进展为ACLF，早期识别高风险患者意义重大。全球范围内，酒精相关疾病和代谢功能障碍相关脂肪性肝病是常见病因，目前缺乏针对AD患者住院期间进展为ACLF的研究。

这项为期2年的多中心前瞻性研究中，研究者收集了来自印度北部、南部和东部的625例AD患者（符合欧洲肝脏研究协会标准）的临床、生化数据以及90天生存数据，开展多中心前瞻性分析研究，将患者分为推导队列（DC）和验证队列（VC）。DC组在入院第0、3、7天收集数据，VC组从各中心数据库收集数据。

将该队列分为推导队列（DC：318例患者）和验证队列（VC：307例患者）。推导出ACLF前期的预测模型，进行验证，并与已有的评分系统，如终末期肝病模型（MELD）3.0 和欧洲慢性肝衰竭联盟急性失代偿评分进行比较。

在625例患者（平均年龄49岁，83%为男性，77.5%患有酒精性肝病）中，32.2%进展为ACLF。与未进展为ACLF的患者相比，进展为ACLF的患者在推导队列中，胆红素水平显著更高（10.9 vs. 8.1 mg/dL）、白细胞计数（9400 vs. 8000 /mm3）、PT-INR（1.9 vs. 1.8）和MELD 3.0 评分（28 vs. 25）更高，但血钠水平更低（131 vs. 134 mmol/L），生存率更低（62% vs. 86%；P<0.05）。在验证队列中，酒精性肝炎、感染和肝性脑病作为额外风险因素，也得到了一致的结果。就诊时的肝衰竭（比值比：推导队列中为2.4，验证队列中为6.9）以及胆红素、PT-INR和MELD 3.0评分在7天内的变化轨迹，均能显著预测 ACLF的进展（P<0.001）。与MELD 3.0和慢性肝衰竭联盟急性失代偿评分相比，一种新的ACLF前期模型显示出更优越的预测能力（推导队列中曲线下面积为0.71，验证队列中为 0.82；P<0.05）。

简评：本研究通过印度患者队列描述了AD患者住院期间进展为ACLF的关键决定因素，发现肝功能障碍、全身炎症和血流动力学异常可预测ACLF进展。现有评分系统在预测AD向ACLF转变方面存在不足，本研究构建的模型能识别高风险患者。研究存在一定局限性，如仅纳入了印度患者，未涉及其他地区人群，可能存在地域局限性，研究结果对全球其他地区患者的适用性有待进一步验证。仅关注了住院期间进展为ACLF的患者，未对出院后患者的疾病进展情况进行跟踪，无法全面反映疾病的长期发展过程。

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Geng A, Brenig RG, Roux J, et al. Circulating monocytes upregulate CD52 and sustain innate immune function in cirrhosis unless acute decompensation emerges. J Hepatol. 2025 Jan 10:S0168-8278(24)02818-6. IF=26.8

简述：肝硬化患者易发生感染性并发症，免疫麻痹是其感染易感性增加的重要原因，免疫麻痹是不同免疫抑制细胞和可溶性因子之间复杂的相互作用，机制尚不清楚。本研究旨在剖析不同肝硬化阶段循环单核细胞状态的异质性，并探究所选差异表达基因的功能。

研究者采用单细胞RNA测序法（scRNA-seq）系统地研究了健康人、代偿期肝硬化患者和非急性失代偿（NAD）肝硬化患者的循环单核细胞。通过流式细胞术和对体外单核细胞的多种功能检测来验证选定的基因。scRNA-seq将单核细胞分为7个簇，不同肝硬化阶段各簇丰度不同。非经典单核细胞在健康人较多，M-MDSC在NAD阶段增多。检测到了健康人与患者之间以及不同肝硬化阶段之间的差异表达基因，其中包括首次发现的CD52。在代偿期和非急性失代偿期肝硬化患者中，单核细胞上的CD52表达显著增强。

在此之前，单核细胞上CD52表达的生物学意义尚不清楚。肝硬化患者中CD52high CD14+CD16high HLA-DRhigh的单核细胞表现出活跃吞噬细胞的功能表型，迁移潜力增强、细胞因子产生能力增加，但激活T细胞的能力较差。急性失代偿（AD）或ACLF发生后，CD52被升高的磷脂酶C（PLC）裂解，循环中可检测到可溶性CD52（sCD52）。在体外和体内实验中，抑制和裂解CD52均显著抑制单核细胞功能。急性失代偿患者中，免疫抑制性的CD52low循环单核细胞占优势，这与感染和较低的无移植生存率相关。

简评：本研究针对肝硬化患者感染并发症这一关键临床问题，深入探究免疫麻痹机制，为改善患者预后提供理论依据，对指导临床治疗具有重要价值。综合运用scRNA-seq、多种细胞功能检测技术、ELISA及免疫组化等多种方法，从基因组学、蛋白质组学和细胞功能多个层面进行研究，全面深入地剖析了单核细胞在肝硬化中的变化及作用机制。研究揭示了肝硬化患者循环单核细胞状态变化，首次发现CD52在单核细胞上的表达变化及其在肝硬化免疫调节中的重要作用，发现CD52高表达单核细胞在早期肝硬化发挥免疫防御作用，AD/ACLF阶段CD52被裂解导致免疫功能恶化，CD52或可作为免疫治疗靶点，sCD52/PLC可作为免疫麻痹的生物标志物。为肝硬化免疫机制研究开辟新方向，也为免疫治疗提供了潜在新靶点。